Монастырь расположен в центре древнего посада Переяслава, к северу от цитадели. В период с 1695 по 1700 годы здесь был построен каменный собор Вознесения Господня, финансируемый гетманом Иваном Мазепой. Вокруг собора были возведены деревянные строения, которые вместе образовали архитектурный ансамбль нового мужского монастыря. В 1700 году, после восстановления епископской кафедры, существовавшей в эпоху Киевской Руси, Вознесенский монастырь стал резиденцией правящего архиерея, что способствовало формированию нового центра города. До 1733 года и с 1785 года епископ Переяславский служил викарием при Митрополите Киевском, а в промежутке между этими датами был архиереем самостоятельной епархии, которая включала в себя не только Переяславщину, но и православное население Правобережной Украины, остававшееся под властью католической Польши до конца XVIII века. В 1785-1793 годах центром епархии временно стал город Слуцк, в 1799 году она была переименована в Малороссийско-Переяславскую, в 1803 году, в Полтавско-Переяславскую, а в 1847 году кафедра была перенесена в Полтаву. До начала ХХ века Переяслав входил в состав Полтавщины. В 1816 году штат братии монастыря был переведен в Саратов, после чего Вознесенская обитель считалась внештатной, а в 1847 году была приписана к Полтавскому Архиерейскому дому.

В 1701 году Мазепа подарил монастырю Пересопницкое Евангелие, перед которым приносят присягу Президенты Украины. Эта рукописная книга, известная своим художественным оформлением, содержит первый известный перевод канонического Евангелия на украинский язык. Евангелие создавалось на Волыни: часть рукописи была выполнена в 1556 году в женском Дворецком монастыре близ Изяслава, другая, в 1561 году в мужском Пересопницком монастыре на Ровенщине. Работа над книгой велась на средства княгини Анастасии Заславской-Ольшанской, принявшей монашество под именем Параскевы. В 1830-х годах книгу обнаружил в библиотеке Переяславской семинарии филолог Иосиф Бодянский, с публикаций которого началось научное изучение Пересопницкого Евангелия как выдающегося памятника духовной книжности Украины. После перевода семинарии в Полтаву, книга покинула Переяслав и впоследствии хранилась в Полтавском историко-краеведческом музее, а после войны, в музее-заповеднике Киево-Печерской Лавры, откуда была передана в Национальную библиотеку Украины им. Владимира Вернадского.

С 1738 года при монастыре действовал Коллегиум, одна из высших школ Украины XVIII века, открытая Переяславским епископом Арсением Берло. Обучение в Коллегиуме было доступно для всех сословий, начиналось в 11 лет и длилось 11-12 лет. Около половины учеников были из малоимущих семей и жили в бурсе на содержании епархии. В низших классах изучались церковно-славянский, латинский и греческий языки, катехизис, основы христианской веры, арифметика и география. В средних классах преподавались поэтика и риторика, а в высших, философия и богословие. В 1753-1754 годах в Коллегиуме преподавал поэтику украинский философ Григорий Сковорода. В 1776 году Коллегиум был преобразован в духовную семинарию, которую в 1862 году перевели в Полтаву. Первоначально Коллегиум размещался в деревянном доме, который сгорел в 1748 году, после чего занятия перенесли в пустующий частный дом. В 1753-1757 годах был построен каменный корпус Коллегиума, который существует до сих пор. С 1862 года здесь находилось духовное училище, а в 1972 году был открыт Мемориальный музей Григория Сковороды.

4 октября 1766 года в Вознесенском соборе была погребена глава святого мученика Даниила Кушнира, старосты Успенской церкви местечка Млиев, казненного за возвращение храма в Православие. Почитание его памяти началось сразу после кончины, а в 1994 году Священный Синод УПЦ канонизировал его, установив празднование 11 августа. С 1786 года в соборе находились мощи преподобного мученика Макария Овручского и Каневского, убитого турками в 1678 году. В 1942 году мощи были перенесены в Черкассы, а память Макария отмечается 7 сентября и 13 мая.

С начала 1920-х годов Вознесенский собор принадлежал УАПЦ, в 1925 году территорию монастыря заняла воинская часть, а в начале 1930-х годов храм превратили в зернохранилище. Во время войны собор лишился купола, а в стенах появились трещины. В 1946 году монастырские здания были признаны памятниками архитектуры национального значения. В 1954-1964 годах собор был отреставрирован, но росписи забелили, и его использовали как склад. В колокольне устроили водонапорную башню. В 1955 году была установлена охранная зона памятника, но часть территории осталась у военных. В 1972 году в здании Коллегиума открыли Мемориальный музей Григория Сковороды, а в 1975 году в соборе был открыт Музей-диорама, посвященный форсированию Днепра советскими войсками в 1943 году. С 1978 года велось строительство нового Исторического музея, но проект не был завершен из-за недостатка финансирования. В 2002 году начался процесс передачи территории воинской части Национальному историко-этнографическому заповеднику «Переяслав». В конце 1990-х годов при соборе была зарегистрирована община УПЦ КП, члены которой собирались в специально оборудованном помещении, позже, в колокольне. Чтобы возрождение святыни происходило в рамках канонической Церкви, 10 февраля 2011 года Священный Синод УПЦ благословил открытие Вознесенского мужского монастыря.