По благословению Патриарха Никона, в период между 1652 и 1662 годами началось строительство мужского монастыря, завершившееся в 1665 году. Однако освящение храма состоялось лишь в 1670 году из-за сложившихся обстоятельств.

Первоначальными строителями и настоятелями монастыря были игумен Исаия и старцы Иосиф, Корнилий и Кирилл.

В 1752 году, в ночь перед Пасхой, берег был размыт рекой Дон, и храм обрушился в воду. После этого монастырь был перенесён в устье балки.

В 1785 году, по инициативе войскового атамана А. И. Иловайского, Усть-Медведицкий монастырь стал женским. В него были переведены 40 девиц из Сиротинского девичьего собрания под руководством дьякона Василия Михайлова. Первой настоятельницей стала вдова войскового старшины Мария Абрамовна Карпова. Последним настоятелем мужского монастыря был игумен Павлин, а также усть-хопёрский священник Петр Евтихиев.

В 1871 году игумения Арсения обратилась к архиепископу Платону с просьбой разрешить строительство храма в честь Казанской иконы Божией Матери и получила одобрение. Проект храма разработал профессор Санкт-Петербургской академии художеств Иван Горностаев. Строительство завершилось летом 1885 года, а освящение состоялось 8 сентября того же года преосвященным Митрофаном. Собор был посвящён Казанской иконе Божией Матери, а внизу была создана церковь с алтарём в честь преподобного Арсения Великого. 15 сентября 1885 года был освящён придел в честь святых апостолов Петра и Павла.

Храм, построенный в византийском стиле в форме креста, вмещает 5000 человек. Колонны с капителями в Казанском храме выполнены из итальянского мрамора, обработанного в Санкт-Петербурге в мастерской Баринова.

В 1928 году монастырь закрыли, часть монахинь подверглась репрессиям. По воспоминаниям учительницы из Котово Тамары Владимировны Поляковой, некоторые монахини создали "коммуну", приобрели дом, где молились и зарабатывали на жизнь. Во время Второй мировой войны они попали в плен к немцам и были увезены в Ростовскую область. После войны некоторые вернулись домой.

В 1992 году, по благословению архиепископа Германа Тимофеева, началось восстановление монастыря.

В августе 2001 года монастырь вновь стал женским.

9 сентября 2012 года состоялось Великое освящение храма Казанской Божией Матери в честь 360-летия Усть-Медведицкого Спасо-Преображенского женского монастыря. Открыли верхний храм, на реставрацию которого ушло более 20 лет.

Храм Преображения Господня с 33 куполами строился усилиями игумении Георгии в течение 10 лет и был освящён в 2014 году. Этот храм задумывался как монашеский. В том же году была построена часовня в честь святого Серафима Саровского.