Первое упоминание о монастыре в летописях датируется 1620 годом, когда его основал инок Геласий. Монахи жили и молились в меловых пещерах, которые по архитектуре и планировке напоминали Киево-Печерские, и были выдолблены в одном из холмов рядом с поселком Чернянка. В этих пещерах находились аскетичные кельи с кроватью и столом, вырубленными из мела, а также подземный храм.

Монастырь просуществовал 144 года и был закрыт в 1764 году по указу императрицы Екатерины II. Вход в пещеры был завален, и богослужения в подземном храме прекратились. Преображенский храм монастыря, построенный в 1650-х годах, стал приходским.

Со временем жители села Холки уже не могли указать место, где находилась построенная в 1757 году надвратная часовня, а вход в подземный монастырь был утерян.

В середине 1970-х годов историки и краеведы проявили интерес к пещерам, и руководство Чернянского района решило их восстановить. Частично отреставрированные холковские пещеры открыли для посетителей в начале 1990-х годов, и работы по восстановлению продолжались.

В 1995 году в подземном Свято-Троицком храме начали проводиться богослужения священнослужителями Чернянского округа. Холки стали посещать не только туристы, но и паломники.

В 1996 году на территории древнего Холковского монастыря епископом Белгородским и Старооскольским Иоанном были освящены три закладных камня для строительства двух храмов и часовни.

Сначала у входа в пещеры был построен надвратный храм во имя Преподобных Антония и Феодосия Киево-Печерских, затем Владимирская часовня.

В декабре 1999 года архиепископ Белгородский и Старооскольский Иоанн освятил монастырский храм в честь Донской иконы Божией Матери. На заседании Священного Синода Русской Православной Церкви 28 декабря 1999 года было благословлено открытие Свято-Троицкого Холковского мужского монастыря.