Монастырь был основан в 1364 году, но от его первых деревянных построек ничего не сохранилось. Значительный расцвет обители связан с Василием III, который в начале XVI века пожертвовал значительные средства на строительство Покровского собора и Святых врат, а также, вероятно, келий и ограды, которые до нас не дошли. Одной из первых узниц монастыря стала жена Василия III, Соломония Сабурова, постриженная в монахини под именем Софии в 1525 году из-за обвинений в бесплодии.

Позже появилась легенда, что Соломония была беременна во время пострижения и родила в монастыре царевича Георгия, который якобы вырос и стал разбойником Кудеяром. В 1934 году реставратор А. Д. Варганов вскрыл гробницу предполагаемого сына Соломонии и нашел там только детскую рубашку. Однако историк Дмитрий Володихин утверждает, что протокол вскрытия гробницы отсутствует, а раскопки 1996 года показали, что погребение было невозможно из-за отсутствия места.

В усыпальнице монастыря под Покровским собором сохранились имена знатных обитательниц, таких как дочь Ивана III Александра, жена Ивана IV Анна Васильчикова, первая жена Владимира Старицкого Евдокия Нагая, Евпраксия Пожарская и царевна Анастасия. Здесь также была заключена вдова Василия Шуйского, царица Мария Буйносова-Ростовская, которая позже переехала в Новодевичий монастырь.

В 1551 году после смерти дочери Ивана Грозного была заново построена Зачатьевская трапезная церковь, заменившая деревянное строение XIV века. В XVII веке к ней пристроили апсиду, появилась поварня и продолжилось строительство ограды.

В 1923 году монастырь был закрыт и разорён. С 1933 года в его стенах разместилась военная биологическая лаборатория, где заключённые специалисты разрабатывали биологическое оружие. В 1934 году она была передана биохимическому институту РККА. В 1935 году Николай Гайский и Борис Эльберт создали первую в мире жидкую вакцину против туляремии. Лаборатория работала до 1936 года.

В 1950-1960-е годы монастырские здания были отреставрированы и стали музейными экспозициями. В 1980-е годы здесь разместился туристско-гостиничный комплекс с рестораном и баром, а в соборе был концертный зал.

С 1992 года в монастыре возродилась монашеская жизнь, и он вновь стал действующим. В его владении находятся собор, здание богадельни и хозяйственные постройки. Избы-кельи были заново построены в 1970-х годах. 22 апреля 2020 года Владимирская епархия получила в безвозмездное пользование приказную избу, последнее здание, не переданное ранее монастырю.