Монастырь был основан преподобным Лукианом Александровским 10 сентября 1650 года на месте, где в 1594 году явилась икона Божией Матери «Рождества Богородицы», позже получившая название Лукиановской. Первым настоятелем стал сам Лукиан, родившийся в 1610 году в Галиче. С восьми лет он воспитывался в монастыре под руководством отца. В 1640 году Лукиан впервые посетил место будущей обители и принял там монашество, хотя трижды был изгнан местными жителями. В 1646 году в Чудовом монастыре Москвы патриарх Иосиф рукоположил его в священники. С поддержкой московских купцов Лукиан построил храм Рождества Богородицы и кельи для монахов. В 1654 году он основал женский монастырь Успения Пресвятой Богородицы в Александрове по просьбе местных купцов. Лукиан скончался 21 сентября 1655 года, и его память отмечают на следующий день. Его дело продолжил преподобный Корнилий, при котором монастырь стал известен своим духовным и архитектурным обликом. Корнилий возглавлял обитель с 1657 года и умер 24 августа 1681 года. Монастырь поддерживали цари Феодор, Иоанн и Петр Алексеевичи, а также другие члены царской семьи. До конца XVII века все постройки были деревянными, но в 1680-1684 годах по указу царя Федора Алексеевича была построена каменная трапезная церковь Богоявления с приделом Федора Стратилата. В конце века началось строительство каменных келий, в 1690 году был возведен Казначейский корпус, в 1696 году Хлебные кельи и Больничная палата, а в 1712 году собор Рождества Богородицы, освященный в присутствии царевен Марфы и Феодосии. В 1771 году между собором и трапезной церковью появилась часовня над гробом Лукиана. В 1714 году при Больничной палате была построена церковь Екатерины. К 1733 году вокруг монастыря возвели каменную ограду с семью башнями. В 1771 году икона Рождества Богородицы прославилась чудом: после крестного хода с образом вокруг Александрова прекратилась эпидемия чумы. С тех пор крестный ход стал ежегодным, а икона получила широкую известность как «Лукиановская». В начале XIX века построили новый Братский корпус и гостиницу к югу от монастыря. В 1894 году интерьер собора Рождества Богородицы был расписан.

Монастырь владел конным, кирпичным и изразцовым заводами, а также несколькими мельницами. Пустыни принадлежали три деревянные часовни на Московской дороге и под Переславлем. В Москве у Сретенских ворот находилось подворье обители. В 1922 году монастырь закрыли, имущество вывезли, часть икон и святынь уничтожили. Местонахождение чудотворной иконы Рождества Богородицы до сих пор неизвестно. В обители разместили дом престарелых с отделениями для душевнобольных и слепых. В 1991 году Лукианова пустынь первой во Владимирской епархии возродилась. В 1992 году были обретены мощи преподобного Лукиана, которые сейчас находятся в храме Богоявления. Мощи преподобного Корнилия были обретены в 1995 году и помещены в Троицком храме Успенского женского монастыря Александрова. В 1999 году по благословению патриарха Алексия II на Афоне была написана икона «Игумения Святой Горы Афон» для обители. К тому времени храм Богоявления был полностью отремонтирован. В 2001 году началась реставрация Богородице-Рождественского собора, но завершилась только восстановлением кровли, глав и куполов. В 2002 году восстановили южную стену, одну из первых каменных построек 1718 года. В 2005 году восстановили одну из семи башен, а в 2011 году еще одну. В начале 2008 года архимандрит Досифей, возглавлявший Лукианову пустынь 17 лет, был переведен в Духовную миссию в Иерусалиме. Он скоропостижно скончался 13 марта 2009 года от сердечного приступа. Чин монашеского погребения состоялся 18 марта в Свято-Даниловом монастыре, а похоронен он на Троекуровском кладбище Москвы. В 2008 году настоятелем Лукиановой пустыни стал игумен Тихон.

29 мая 2011 года прошли торжества в честь 20-летия возрождения Свято-Лукиановой пустыни и Свято-Успенского женского монастыря Александрова. Обитель была удостоена медали святого благоверного князя Андрея Боголюбского I степени за усердное служение.