Монастырь был основан в 1371 году Димитрием, игуменом Никольского монастыря в Переславле-Залесском, который был близким последователем и духовным другом Сергия Радонежского. Димитрий принял монашество в Успенском Горицком монастыре и вскоре, став священником, основал Никольский монастырь «на Болоте», где стал игуменом.

Согласно житию Димитрия, он покинул Переславль, избегая славы, и отправился на Север с учеником Пахомием. Они остановились недалеко от Вологды, у реки Лежи, где построили церковь Воскресения. Однако местные жители не одобрили их присутствие, и Димитрий с Пахомием продолжили путь. Достигнув Вологды, Димитрий заметил, что в городе нет церкви Всемилостивого Спаса и общежительного монастыря.

Строительство монастыря поддержал Дмитрий Донской, который жертвовал средства на его возведение. Первый деревянный храм был освящён в честь праздника Всемилостливого Спаса и Пресвятой Богородицы. Рядом были построены кельи для монахов.

Во время игуменства Димитрия монастырь назывался лаврой. Многие ученики последовали за ним из Переславля в Прилуки, и здесь впервые на Русском Севере был введён общежительный устав. Димитрий скончался 11 февраля около 1406 года и был похоронен в Спасском соборе. Перед смертью он благословил Пахомия стать игуменом.

После его смерти Димитрию приписывают множество чудес, в том числе изгнание бесов и помощь монастырю и Вологде.

В 1918 году в монастыре провели обыск, часть зданий заняли красноармейцы. Во время Гражданской войны в башнях хранили взрывчатые вещества, и пожар едва не уничтожил памятник. В монастыре была создана община из местных жителей. С 1919 по 1923 годы изымались церковные ценности. Архимандрит Нифонт Курсин и монахи были выселены, протестовавшие прихожане репрессированы. В 1922 году местные жители просили разобрать стены на кирпичи, но просьба была отклонена.

В 1924 году монастырь закрыли, а произведения искусства передали в Вологодский музей. В 1930-х годах здесь была пересыльная тюрьма, в 1950-х и 1970-х, военные склады. В монастыре также располагались кинотеатр и дом инвалидов. С 1950-х годов началась реставрация, возвращавшая постройкам облик XVI-XVII веков. В 1979 году монастырь стал филиалом Вологодского государственного музея-заповедника.

16 июня 1990 года состоялся крестный ход, а в августе Вознесенская церковь была передана церкви. В 1991 году монастырь вновь стал мужским епархиальным. 24 февраля 1992 года монастырь был полностью возвращён Русской православной церкви. Патриарх Алексий II посетил монастырь в 1992 и 2007 годах.

В последующие годы монастырская жизнь возродилась, были отремонтированы строения, восстановлены иконостасы и колокола. Проводятся ежедневные богослужения, действует подворье и воскресная школа. Здесь находится отделение Вологодского православного духовного училища. Ежегодно проходят Димитриевские образовательные чтения.

Подворьем монастыря является церковь Димитрия Прилуцкого в Вологде, а с 1994 по 2003 год, Свято-Троицкий Павло-Обнорский мужской монастырь в Грязовецком районе.