История храма начинается с создания кладбища. В период с 1760 по 1770 годы эпидемии сильно опустошали Россию. Одной из причин постоянных болезней считали кладбища внутри городов, и в 1772 году Екатерина Великая распорядилась создать новые кладбища за пределами городов. В 1782 году землемер Неелов описал Богородицкое кладбище как расположенное по течению реки Вологды, вверх по левой стороне, напротив старого кладбища церкви Николая Чудотворца, что на Глинках, в трехстах саженях от последней черты вала. Первоначально отпевания проходили в Глинковской церкви, поэтому кладбище называли Заглинковским Николаевским. Захоронения здесь начались с 1781 года.

Первая каменная церковь была построена не позднее 1790 года и получила название Рождества Пресвятой Богородицы на Глинковском кладбище. Позже кладбище стало главным в городе, но храм оказался слишком мал для вологжан. Строительство нового храма, который стоит и поныне, началось в 1832 году под руководством церковного старосты Александра Ивановича Попова-Тестова. Церковь была построена и освящена в 1836 году. Она была каменной, с такой же колокольней, расположенной в куполе над холодной церковью, двухэтажной и крепкой. В начале XX века по инициативе старосты Николая Кубрякова была удлинена трапезная часть храма и переделан вход на второй этаж, что придало церкви современные очертания.

Во второй половине 1930-х годов власти стремились закрыть храм. В 1937 году кладбище было закрыто для захоронений, а в 1938 году закрылся верхний "обновленческий" храм из-за отсутствия прихожан. В здании разместили архив НКВД. В 1937 году НКВД арестовал всех вологодских священников за одну ночь. Избежали ареста только о. Александр Беляев, который отсутствовал в городе, и Николай Добряков, страдавший тромбофлебитом ног. Почти год, превозмогая боль, он продолжал служить в храме, что стало настоящим подвигом. В 1939 году во время службы у него случился приступ, и его увезли в больницу, где он скончался. Власти вновь подняли вопрос о закрытии нижнего храма, но православная община устояла. Через три месяца нашли нового священника, Анатолия Городецкого.

В годы войны и в первые послевоенные годы многие вернулись в Церковь. Власти были вынуждены вновь открыть ряд храмов. Встал вопрос об открытии Воскресенского кафедрального собора, особенно актуальный в 1947 году, накануне 800-летия города. В это время искали "хозяина" собору: сначала областной музей, затем клуб, и наконец картинная галерея. Однако чиновники были вынуждены пойти на компромисс и вместо Воскресенского собора вернули верующим верхний храм Богородицкой церкви, который стал кафедральным собором. 18 августа 1992 года Святейший Патриарх Московский и всея Руси Алексий II совершил Божественную Литургию в Рождество-Богородицком кафедральном соборе.