Зачатьевская церковь была построена в 1686 году. Каменный храм, возведённый митрополитом Ионой в честь Святой Троицы как собор Яковлевского монастыря, получил роспись в 1689-1690 годах от ярославских мастеров, возможно, под руководством Дмитрия Григорьева Плеханова. Роспись в основном повторяла иконографические приемы, сложившиеся в митрополичьих храмах Ростова в 1670-1680 годах. Стены были разделены на пять ярусов. В четырёх нижних изображалась земная жизнь Христа, в основном по Евангелию от Матфея. В углу храма, на нижнем ярусе, где стояла гробница святого Иакова Ростовского, добавили сцены рождения и кончины основателя монастыря. Верхние люнеты стен занимал ярус с сюжетами из истории Святой Троицы. На сводах изображались праздники, а на алтарной преграде прямо на стене был написан иконостас. Колорит росписи выдержан в характерной для Плеханова зеленовато-охристой гамме. Отдельные клейма отличаются точными пропорциями и схематизмом. Слева обычно изображены апостолы, а справа Христос, совершающий чудо. На столбах написаны фигуры мучеников, на нижних арках, красные херувимы, а на верхних, апостолы. Система росписи алтаря необычна для ростовских храмов и ближе к ярославским традициям. В конхе жертвенника вместо «Великого входа» и «Агнца в потире» изображена «Похвала Богоматери». В конхе дьяконника вместо «Семи таинств», полуфигура Саваофа, благословляющего двумя руками. На стене алтаря, где обычно в ростовских храмах изображается «Почи Бог», написаны «София Премудрость Божия» и «Преломление хлеба апостолом Петром». На столбах и выступах алтарных апсид в медальонах изображены деятели вселенской и русской церкви, такие как Григорий епископ Армении, Стефан Сурожский и другие. Значительная часть алтаря посвящена циклу «Страстей Христовых». Дьяконник отделен от алтаря каменной преградой, на западной стороне которой изображено «Древо Иессеево», а на восточной, «Богоматерь Знамение». В апсиде дьяконника изображены архидьяконы, а в центральном алтаре, вселенские святители и патриархи. В 1778 году артель ростовских иконописцев под руководством Андрея Матвеева обновила роспись в храме. Реставрация проводилась под наблюдением иеромонаха Амфилохия, который в 1770-х годах по указу Екатерины II реставрировал соборы Московского Кремля. Амфилохий похоронен на паперти Зачатьевской церкви рядом с племянником архимандритом Иннокентием. В 1761-1764 годах резчики Сысой Изотов Шоломотов и Степан Никитин Бочкарев создали великолепный 5-ярусный иконостас, закрывший первоначальный иконостас Ионы Сысоевича. Иконостас украшен полукруглыми фронтонами, колоннами, виноградными гроздьями и херувимами и относится к лучшим произведениям русского барокко. Завершается он группой «Вознесения» с Христом на фоне облаков и ангелов. В 1776-1779 годах иконостас был позолочен Иваном Даниловым Сантеевым, который также создал резные сени над гробницами святых Иакова и Димитрия Ростовского. Иконы для иконостаса в 1780 году написал придворный живописец Екатерины II Венедикт Вендерский. Среди утвари храма, серебряная рака святого Димитрия Ростовского с надписью от М. В. Ломоносова, вклад императрицы Елизаветы Петровны. В XIX веке была выполнена наружная роспись на фронтонах паперти Зачатьевской и Яковлевской церквей. Фигуры Христа, Иакова и Димитрия написал в 1826 году ростовский иконописец Н. Д. Гладков, а клейма с изображением «Зачатия святой Анны» и «Святой Троицы» в 1827 году, монастырский художник В. А. Птишников.