Обитель была основана в период появления новых монастырей в конце XIV и начале XV веков последователями Сергия Радонежского. В 1397 году монах Кирилл Белозерский выкопал пещеру на берегу Сиверского озера, положив начало истории будущего монастыря. Его спутник, Ферапонт Белозерский, позже основал неподалёку Ферапонтов монастырь. Устав белозерских монастырей отличался особой строгостью.

В условиях соперничества Москвы с независимым Новгородом Кириллов монастырь стал важным опорным пунктом для закрепления в Заволочье и крупным экономическим центром. Через него проходил торговый путь на север к Белому морю, пересекались различные торговые потоки. До петровских времён монастырь активно торговал, особенно солью и рыбой.

Многие сохранившиеся храмы были построены из камня в конце правления Василия III. В 1528 году он посетил Кириллов монастырь с княгиней Еленой Глинской, чтобы молиться о наследнике. Рождение сына, будущего царя Ивана Грозного, связывали с заступничеством преподобного Кирилла Белозерского. Иван Васильевич всю жизнь испытывал особую привязанность к монастырю, считая его своим спасителем. Перед смертью, приняв схиму, первый русский царь, как и его отец, стал пострижником Кирилло-Белозерского монастыря.

Монастырь богател и расширялся, несмотря на пожар в 1557 году, став крупнейшим центром каменного строительства на севере Русского государства и вторым по величине церковным землевладельцем после Троицкого монастыря. В его владениях числилось 607 деревень. Настоятели Кириллова занимали важные места в церковной иерархии и часто переходили на значимые архиерейские кафедры.

В 1722 году монастырь посетил Пётр I. К тому времени обитель владела 21 тысячей крестьян в 16 уездах, но с открытием балтийских портов и упадком северной торговли через Архангельск её экономическое значение снизилось.

Постепенный упадок монастыря продолжался и при последующих правителях. В 1764 году указом Екатерины II монастырь лишился крестьян и угодий. Через 12 лет из монастырской слободы образовали город Кириллов, а в крепостной стене разместили городскую и уездную тюрьму.

В 1997 году, к 600-летию монастыря, часть его территории передали Вологодскому епархиальному управлению. В 1998 году была зарегистрирована Православная религиозная организация Кирилло-Белозерский мужской епархиальный монастырь.

Решением Священного синода от 10 октября 2009 года иеромонах Игнатий Молчанов был назначен наместником монастыря. Однако 22 октября 2015 года он был освобождён от этой должности и назначен на пост наместника Спасо-Прилуцкого монастыря в Вологде. С 14 декабря 2015 года исполняющим обязанности наместника стал иеромонах Анастасий Додарчук.

До наших дней почти полностью сохранился иконостас Успенского собора, что уникально для истории русского искусства. Древние иконы долгое время были разрознены: из 60 уцелевших 33 находились в Кириллове, остальные в Русском музее, Третьяковской галерее и Музее имени Андрея Рублёва. В апреле 2009 года часть икон вернули в Кириллов.

В церкви Кирилла под спудом находятся мощи преподобного Кирилла Белозерского, главная святыня обители.

В апреле 2019 года стало известно, что Министерство культуры России передаст монастырю на пять лет ковчег с частицами мощей 20 святых. Монастырь планирует создать новый серебряный оклад для ковчега, после чего мощи будут перенесены в церковь Кирилла Белозерского.