В 20-х годах XVI века архиепископ Макарий ввел общежительный устав в новгородских монастырях, что привело к строительству трапезных в ряде обителей. В 1557 году в Духовом монастыре по заказу игумена Ионы была возведена каменная трапезная с церковью Троицы Живоначальной.

Изначально церковь Троицы, вероятно, имела придел Николая Чудотворца, упомянутый в описи 1591 года. В документах 1582 и 1686 годов этот придел ошибочно назван отдельной церковью, но когда он был упразднен, неизвестно. На первом этаже трапезной находились поварня, хлебня и два квасных погреба, а на втором, трапезная и келарская. Здание сильно пострадало во время шведской оккупации в 1611 и 1617 годах, а также от пожара в 1685 году.

В 1812 году на верхнем этаже трапезной появился придел Тихвинской иконы Божьей Матери, а в 1821 году в северо-восточной части этого этажа была устроена ризница. Архиепископ Макарий в 1860 году описывал, что к трапезной с западной стороны примыкает старинный двухэтажный корпус для сестер.

В XIX веке, в точности неизвестно когда, трапезная и церковь были частично перестроены: центральный столб и своды верхнего этажа разобрали, над трапезным залом сделали плоское покрытие, а некоторые оконные проемы изменили. Завершение церкви переделали на четырехскатное. Вероятно, работы проводились в 20-х годах XIX века, так как в 1822 году Александр I выделил 10 000 рублей на ремонт монастырских церквей. В 1910 году к югу от церкви Троицы построили новый одноэтажный каменный трапезный корпус с церковью Владимира, Михаила Тверского и мученицы Наталии.

Церковь Троицы Живоначальной относится к типу бесстолпных, пятиглавых, трехапсидных храмов с подцерковьем и подвалом. Подвал состоит из одного прямоугольного помещения, разделенного поздней перегородкой с проемом. Помещение перекрыто коробовым сводом с распалубками. В западной стене расположены две каменные лестницы. Основной объем церкви решен нетрадиционно: подпружные арки на парусах поддерживают центральный барабан с невысоким сферическим сводом. Фасады украшены изящным декором с арками и нишами с килевидным завершением. Церковь сложена из известняковой плиты с кирпичной облицовкой на известковом растворе. Покрытие церкви тесовое, апсиды и главы барабанов покрыты городчатым лемехом, трапезная имеет двускатное покрытие.

Церковь Троицы Живоначальной является высокохудожественным образцом середины XVI века, обладая рядом уникальных композиционных, конструктивных и декоративных особенностей, а также стройными пропорциями. Она сильно пострадала во время Второй мировой войны, но была реставрирована в 1963 году по проекту архитектора Т. В. Гладенко.