Храм находится на месте бывшего мужского Троицкого монастыря, основанного при Борисе Годунове. Изначально Троицкая церковь была деревянной. В 1742 году построили каменное двухэтажное здание, которое затем несколько раз перестраивали. Нижний храм стал зимним, а на втором этаже разместилась летняя церковь в более просторном и светлом помещении.

Церковь Троицы Живоначальной является одним из самых старинных храмов Курска. В 1940 году, в период советской власти, храм закрыли, а в начале Великой Отечественной войны сняли колокольню, на месте которой разместили пост ПВО. Во время немецкой оккупации храм вновь открыли для богослужений.

Храм функционировал до 1961 года. В 1989 году здание отремонтировали и разместили в нем планетарий. Епархии вернули первый этаж в 1992 году, а второй, в 1995 году. Сейчас в храме находятся престолы Святой Троицы, преподобного Амвросия Оптинского, благоверных князей Бориса и Глеба в нижнем храме, а также престол Святого Духа и святителя Николая Чудотворца в верхнем храме.

С 2015 по 2018 годы были проведены реставрационные работы, которые включали обновление фасадов, фундамента, главок, радиально-криволинейной и скатной кровли, а также козырьков.