Достоверные сведения о монастыре, который в то время был небольшим и малочисленным, появились в середине XVI века. В позднем житии Киприана Устюжского говорится, что обитель существовала на этом месте ещё в домонгольский период. Известно, что монастырь расположен на холме Глядень, где в средние века находился русский город Гледен, основанный, согласно местному преданию, Всеволодом Большое Гнездо.

С увеличением торговых операций устюжских купцов в XVII веке укреплялась и Гледенская обитель. В середине XVII века благодаря средствам купцов Грудцыных и с благословения митрополита Ионы Сысоевича началось строительство кирпичных зданий. В 1697 году в Троице-Гледенском монастыре было учреждено архимандритское правление. Тогда основание обители связывали с 1492 годом, утверждая, что «Троицкий Гледенский монастырь, говорят, архангелские помогали строить, хлебом снабжали и рабочих людей посылали для заготовки и транспортировки церковного леса».

Современный ансамбль монастыря сложился в конце XVII, первой половине XVIII века. Сначала был возведён двухстолпный Троицкий собор, по образцу собора Архангельского монастыря в Устюге. Затем построили тёплую Тихвинскую церковь с трапезной, церковь Успения Богоматери и больничную палату. В XVIII веке Тихвинская церковь была соединена с Троицким собором крытой галереей. Каменная ограда так и не была завершена из-за нехватки средств.

В 1784 году завершилось создание нового иконостаса в барочном стиле, работы над которым местные мастера вели восемь лет. В качестве образца использовался иконостас старого собора Яковлевского монастыря в Ростове. Этот иконостас сохранился и известен своей резьбой по дереву.

Монастырь был упразднён в 1841 году из-за малочисленности братии и приписан к Михайло-Архангельскому монастырю. В 1912 году он вновь открылся как женская обитель.

В 1925 году монастырь был снова упразднён. Троицкий собор с иконостасом был закреплён за музеем как памятник архитектуры, а остальные постройки использовались под колонию для беспризорников, детский дом-изолятор, пересыльный пункт для раскулаченных, дом инвалидов и дом для престарелых.

В начале 1980-х годов здания были переданы музею.

16 июля 2014 года епископ Игнатий Депутатов распорядился создать архиерейское подворье «Троице-Гледенский монастырь».