В 1591 году, когда Казы-Гирей приблизился к Москве, царь Федор Иоаннович приказал провести крестный ход с Донской иконой Богородицы вокруг городских стен и затем разместить ее в походной церкви русского войска. В ночь перед иконой царь имел видение, подтверждающее его действия. Когда враг подошел к лагерю, произошло несколько стычек, но сражение так и не началось. Войско Казы-Гирея простояло сутки и внезапно в панике отступило, оставив раненых и снаряжение.

Донской монастырь был основан на месте, где русские войска стояли перед битвой с татарами. В центре лагеря была установлена походная церковь с Донской иконой. Москвичи называли монастырь обителью Богородицы "что в обозе".

Иконой Богородицы преподобный Сергий Радонежский благословил князя Дмитрия Иоанновича на Куликовскую битву в 1380 году. После этого икона находилась в Успенском соборе Коломны, а затем была перенесена в московский храм Рождества Богородицы и позже в Благовещенский собор Кремля. С тех пор икона стала известна как "Донская". Каждый раз, когда Москве угрожала опасность, перед ней молились о помощи.

С основанием монастыря был построен каменный собор в честь Донской иконы, который позже стал трапезным. Донской монастырь стал частью оборонительного кольца монастырей-крепостей вокруг Москвы, защищая ее от врагов. Он был задуман как форпост на Калужской дороге.

В начале XVII века монастырь был захвачен и разграблен поляками под руководством Ходкевича. После этого он пришел в упадок и был приписан к Андроникову монастырю. Обитель возродилась в 1620-х годах благодаря царям Михаилу Федоровичу и Алексею Михайловичу, став местом паломничества.

С 1684 года начинается строительство Нового собора и монастырских стен, напоминающих стены Новодевичьего монастыря. В 1705 году по указу Петра I настоятелем стал архимандрит Лаврентий, и монастырь стал центром российско-грузинских связей. Здесь нашли упокоение представители грузинской знати.

В 1745 году монастырь получил статус ставропигиального. После эпидемии чумы 1771 года монастырское кладбище стало местом захоронения московской знати. К концу XVIII века монастырь стал одним из самых почитаемых в Москве.

В 1812 году монастырь был разграблен армией Наполеона, но здания уцелели. В XIX веке продолжалось формирование архитектурного ансамбля. В 1834 году открыто духовное училище для подготовки воспитанников к семинарии.

После Октябрьской революции 1917 года в монастыре находился Патриарх Тихон. В 1926 году монастырь закрыли, и его здания использовались под музей и другие нужды. В 1935 году здесь открылся музей русской архитектуры.

В 1948 году Малый собор был возвращен Московской патриархии. В 1990 году монастырь полностью вернулся в ведение Церкви. С тех пор ведутся реставрационные работы, построены новые храмы и действуют различные образовательные и культурные учреждения.