Крестовоздвиженская церковь была возведена в 1893 году с благословения известного миссионера, епископа Уфимского Дионисия Хитрова. В освящении храма участвовал священник-миссионер Евграф Еварестов, который позже провел здесь беседы со старообрядцами и был канонизирован как священномученик. Первым настоятелем стал протоиерей Николай Котельников, которого прихожане считали «добрым пастырем и добрым отцом». Он похоронен у алтаря церкви рядом с церковным старостой и главным благотворителем, купцом Трофимом Козловым.

До революции приход Крестовоздвиженской церкви был одним из крупнейших в Уфе, в основном состоящим из рабочих. При храме действовало церковное попечительство, оказывавшее помощь бедным жителям Нижегородки и семьям солдат во время Первой мировой войны. Также при церкви была церковно-приходская школа.

Когда у отца Николая Котельникова родился глухонемой сын, он, переживая за его судьбу, решил помочь и другим детям с таким недугом, открыв в 1902 году училище для глухонемых на благотворительные средства. Одним из первых пожертвовал на это дело святой Иоанн Кронштадтский. Попечительство Императрицы Марии Федоровны прислало для училища специально обученную учительницу из Петербурга. Во время Первой мировой войны училище стало военным лазаретом на 94 койки. В 1914 году к зданию пристроили храм во имя святителей Ермогена и Николая, на строительство которого пожертвовал средства Николай II.

В советское время прихожане Крестовоздвиженской церкви дежурили у храма, чтобы предотвратить его закрытие. С 1933 по 1937 год церковь была кафедрой епископа Руфина Брехова, который возглавлял Уфимский епархиальный совет автокефальных староцерковных общин. После его ареста и закрытия церкви в здании разместили склад минеральных удобрений. По просьбам верующих церковь вновь открыли в 1942 году.

За организацию сбора пожертвований для фронта настоятель А. Горин и церковная староста М. Чумакова были награждены медалями «За доблестный труд в Великой Отечественной войне». М. Чумакова устроила на работу сторожем Николая Чигвинцева, который позже стал известен как преподобный Моисей Уфимский. Это было его первое место церковного служения, откуда он ушел в Сергиевский собор. Ель у алтаря церкви была посажена его руками. В разное время здесь служили схиепископ Петр Ладыгин, архимандрит Пантелеимон Степаненко, игумен Софроний Шаробыров, игумен Илья Бобровников, священники Аркадий Маринин, Феодор Троицкий, Игорь Марков и другие.

В советский период, когда большинство храмов были закрыты, Крестовоздвиженская церковь оставалась местом паломничества для верующих из многих сел и деревень Уфимской епархии. В 1994 году на территории храма был открыт Крестовоздвиженский Благовещенский монастырь, а после его переноса в Стерлитамак в 1998 году, протоиерей Роман Хабибуллин создал здесь братство для бездомных и социальный приют.