Когда-то этот храм, один из самых древних в Москве, был центром округа и выглядел значительно больше, чем сейчас.

В XIV веке на этом месте находилось дворцовое село Напрудное, окруженное прудами и рекой, которая была притоком Неглинной. Здесь появился Государев Воловий двор, а окрестности Напрудного стали популярны для соколиной охоты. Легенда о создании церкви святого Трифона связана именно с этим. По преданию, князь Патрикеев во время охоты потерял сокола и, боясь гнева монарха (по одним источникам Ивана III, по другим, Ивана IV Грозного), молился святому Трифону. Сокол был найден благодаря святому, и в благодарность князь Патрикеев построил Трифоновскую церковь. В конце XVI, начале XVII века в интерьере храма появилась фреска, изображающая святого Трифона на коне с соколом на руке.

Трифоновская церковь, одноглавый бесстолпный храм с крещатым сводом. Датировка каменной церкви вызывает споры среди исследователей. Некоторые относят её к концу XV века, основываясь на надгробной надписи и использовании белого камня. Упоминается даже 1492 год. Другие считают, что храм был построен в середине или второй половине XVI века. С.В. Заграевский предположил, что церковь была возведена в середине 1470-х или 1480-х годов.

В XVIII веке к храму добавили трапезную с приделом святого Николая Чудотворца и колокольню. В XIX веке митрополит Черногории подарил храму частицу мощей святого Трифона, вставленную в икону. В 1861 году в трапезной появился второй придел в честь Филарета Милостивого, покровителя митрополита московского Филарета.

На рубеже XIX-XX веков храм значительно изменился и увеличился. В 1889 и 1892 годах по проекту архитектора П.П. Зыкова была построена вторая колокольня в псевдорусском стиле, а в 1894 и 1898 годах, новая трапезная. В 1911 году появился новый мраморный иконостас с Царскими Вратами, созданный архитектором Ф.О. Шехтелем. Однако после закрытия храма в 1932 году интерьеры были утрачены.

Икона святого Трифона с частицей мощей сохранилась, так как была перенесена в церковь Знамения в Переяславской слободе, которая не закрывалась в XX веке. После закрытия Трифоновского храма он утратил все пристройки XVIII и XX веков и вернулся к первоначальным размерам. Благодаря реставраторам удалось сохранить древнюю часть здания. Фреска с изображением святого Трифона была перенесена в Третьяковскую галерею. В 1947 и 1948 годах в ходе реставрации, организованной Л.А. Давидом, была восстановлена историческая форма главы и создана маленькая звонница. Вокруг храма выросли больничные корпуса, а место утраченных приделов отмечено деревянными крестами.