Мощи преподобного Стефана были оставлены под спудом, а над ними вскоре построили каменную церковь, которая стала северным приделом нового Троицкого храма. Придел освятили в 1558 году в присутствии Ивана Грозного и царевны Анастасии, пожертвовавшей облачения на престол, пелены для икон и покров на раку преподобного. Благодаря усилиям игумена Амфилохия и частично на его средства в Стефановском храме обновили стенные росписи и предалтарный иконостас. С 1885 года все настенные росписи в монастыре выполнял александровский живописец Фёдор Дмитриевич Лавровский. Вместе с сыновьями Фёдором и Дмитрием, обучавшимися в Московском Строгановском училище, он часто бывал в Махре, выполнял множество живописных работ, в 1906 году расписывал реконструированный Стефановский храм и обновлял иконы. К 500-летию со дня кончины преподобного Стефана Стефановский храм был значительно перестроен. Освящение перестроенного храма состоялось 5 июня 1906 года под руководством архимандрита Товия из Свято-Троицкой Сергиевой лавры в сослужении с Махрищским строителем Мелхиседеком и братией. Монастырь закрыли 5 января 1923 года. В 1942 году Стефановскую и Троицкую церкви, а также колокольню разобрали, а щебень использовали для строительства аэродрома в деревне Слободка Киржачского района. В 1995 году насельницы обратились за помощью к президенту концерна "Росэнергоатом" Эрасту Николаевичу Поздышеву, который вместе с сотрудниками более десяти лет занимался возрождением обители. Сегодня концерн возглавляет его преемник Сергей Александрович Обозов, который продолжает заботиться о монастыре. Летом 1996 года начались изыскательные и археологические работы по исследованию остатков Стефановского храма. Фундамент из крупных валунов оказался в хорошем состоянии. 14 октября 1996 года состоялась торжественная закладка первого камня, и были привезены колокола. Впервые за 75 лет окрестности наполнились звоном. 14 октября 1997 года на храм был поднят крест, а 25 ноября состоялось его освящение. Из летописи монастыря от 25 ноября 1997 года: "Около десяти часов утра прибыл Святейший Патриарх Московский и всея Руси Алексий II. С пением тропаря Святой Троице Предстоятеля Русской Православной Церкви проводили в новый храм. Этот храм, построенный над обретёнными мощами преподобного Стефана Махрищского и считавшийся ранее северным приделом Троицкого собора, был первоначально освящён в 1558 году в присутствии царя Иоанна Грозного. И вот теперь, спустя почти 440 лет, престол во имя преподобного Стефана Махрищского освятил Святейший Патриарх. Впервые после стольких лет запустения Его Святейшеством была принесена Бескровная Жертва над местом погребения Махрищского чудотворца".

В канун праздника Пятидесятницы, 16 июня 2000 года, была установлена икона Святой Троицы и басменный крест, увенчавший трехъярусный иконостас. В 2006 году у западной стены воссоздали крытую паперть в том виде, в котором она была пристроена в 1912 году. К 600-летию со дня преставления преподобного Стефана, летом 2006 года, над местом его упокоения установили раку с сенью, выполненную в технике басмы с элементами чеканки и литья. Автором работы стал Максим Лавданский. В 2007-2010 годах храм был украшен наружными росписями и изразцами, выполненными художниками мастерской "Киноварь" и сестрами обители.