В 1363 году Сергий Радонежский благословил новгородских монахов Фёдора и Павла на создание монастыря. Легенда гласит, что Сергий выбрал место для строительства нового монастыря, предсказав его процветание: "Бог и Пресвятая Богородица благословят это место, а Борис и Глеб помогут, возвысив монастырь". Все постройки изначально были деревянными, и в таком виде монастырь просуществовал 159 лет.

Борисоглебский монастырь пользовался особым расположением московских князей и первых русских царей, которые считали его своим "домашним". В период междоусобной войны XV века здесь нашёл убежище великий князь Василий II Тёмный. В 1440 году игумен Питирим крестил в монастыре Ивана III, сына Василия Тёмного. Иван III, как и его отец, щедро одаривал монастырь. При его сыне, Василии III, в 1522 году началось каменное строительство. Для этого был приглашён мастер Григорий Борисов. В монастыре наладили производство кирпича, добывали песок и известь, привозили валуны для фундаментов. Иван IV Грозный трижды посещал монастырь, впервые в 1545 году, и сделал более 20 вкладов, включая книги, деньги и колокол весом 138 пудов. Вклады делали также цари Борис Годунов, Алексей Михайлович и другие знатные семьи. К середине XVII века монастырь владел 22 тыс. десятин земли и четырьмя подведомственными монастырями, что делало его одним из богатейших в Ростовской митрополии. В начале XVII века здесь подвизался преподобный Иринарх, который предсказал Василию Шуйскому "пленение Руси поляками". Монастырь посещали полководцы и князья, видевшие в Иринархе духовного наставника.

В конце XVII века, одновременно с постройкой Ростовского кремля, по указанию митрополита Ионы Сысоевича, в монастыре начались масштабные строительные работы. Однако секуляризация церковных доходов и земель при Петре I и Екатерине II превратила монастырь в заурядный второклассный. В XVIII-XIX веках монастырь существовал за счёт 280 десятин земли, сада и доходов от аренды башен и лавок. Из царствующих особ здесь побывали только Екатерина II и Александр III, и то проездом.

Официально монастырь был упразднён в 1924 году. Часть зданий передали Ростовскому государственному музею, часть осталась у верующих. К концу 1929 года действующих храмов не осталось. В 1989 году богослужения в соборе Бориса и Глеба возобновились, а в декабре 1994 года был возрождён Борисоглебский мужской монастырь. С 1924 года на его территории действует музей-филиал Государственного музея-заповедника "Ростовский кремль", где представлены экспозиции и открыты для посещения переходы крепостных стен и смотровая башня.