Монастырь был основан в 1650 году игуменом Мгарского монастыря Каллистратом при поддержке Киевского митрополита Сильвестра Косова и на средства первого полтавского полковника Мартына Пушкаря, а также других представителей казацкой старшины и горожан. В 1695 году монастырь был сожжен крымчаками, а в 1709 году шведы, разместив здесь свои пушки, обстреливали город. По преданию, Карл XII получил ранение в ногу неподалеку от монастыря, что ограничило его подвижность в день Полтавской битвы. В память о победе, с 1803 года архимандритам монастыря было предписано носить на мантиях образы преподобного Сампсона Странноприимца и святого великомученика Георгия Победоносца. В 1857 году к монастырю был приписан Свято-Сампсониевский храм на поле сражения.

С 1775 по 1786 годы монастырь служил резиденцией епископов Славянских, а с 1786 по 1797 годы, Екатеринославских. Здесь был похоронен известный своими проповедями и благочестием Екатеринославский архиепископ Амвросий Серебренников в 1792 году и святитель Афанасий Вольховский в 1801 году. В 1790-х годах в монастыре жил викарий Екатеринославской епархии епископ Иов Потемкин. С 1884 года монастырь стал резиденцией викарного епископа Прилукского. Обитель была закрыта в 1923 году, возрождена как женская в 1942 году, снова закрыта в 1960 году и вновь возрождена в 1991 году.

В монастыре началась история Славянской семинарии, созданной трудами архиепископа Евгения Булгариса. В 1778 году здесь была открыта школа для подготовки монастырских певчих, которая вскоре была преобразована в духовное училище и переведена в город, где в 1780 году стала семинарией. До переноса семинарии в Новомиргород в 1798 году, здесь учились такие известные личности, как Иван Котляревский, Николай Гнедич и Василий Гоголь-Яновский. Семинария находилась под управлением епископов Славянских, а ее ректорами были архиепископ Никифор Феотоки и митрополит Гавриил Банулеско-Бодони. С 1818 года при монастыре существовало мужское духовное училище, которое до 1876 года располагалось в здании на склоне холма, а затем было переведено в город.

Территория монастыря вытянута с севера на юг в форме узкого ромба с усеченными вершинами. Она окружена кирпичной оградой, построенной в первой половине 1990-х годов. В центре северной части находится 47-метровая колокольня 1786 года в стиле украинского барокко, напоминающая Великую колокольню Киево-Печерской Лавры. Западнее колокольни расположены святые врата. Севернее колокольни, за пределами монастыря, в 1991 году был установлен памятный знак в честь уничтоженного в советское время монастырского некрополя. На юг от колокольни находятся Крестовоздвиженский собор, храм Святой Троицы и храм святого праведного Симеона Богоприимца.

Крестовоздвиженский собор был построен на стыке XVII и XVIII веков в стиле украинского барокко, сочетая элементы древнерусского, деревянного украинского и западного зодчества. Между колокольней и собором находится могила монахини Антонии Жартовской, собравшей подписи за возрождение монастыря. Между собором и храмом Святой Троицы расположена ротонда над чтимым источником.

Храм Святой Троицы был построен в 1995-1999 годах на месте разрушенной в советское время одноименной церкви XVIII-XIX веков, служившей местом погребения архиереев. В 2001 году в крипте храма был похоронен митрополит Полтавский и Кременчугский Феодосий Дикун.

Храм святого праведного Симеона Богоприимца был сооружен в 1887 году полтавским меценатом Иннокентием Котельниковым в память о его единственном сыне Симеоне, который умер в Полтаве по пути на юг для лечения от туберкулеза. Перед смертью мальчик завещал похоронить себя в Крестовоздвиженской обители, которая ему очень понравилась.

Вдоль западной части ограды монастыря, напротив собора, расположен корпус келий, построенный в 1770 году и обновленный в 1863 и 1892 годах. Южнее, напротив храма Святой Троицы, имеющего статус прихода, в 1990-х годах был построен дом приходской Свято-Троицкой общины. Еще южнее, вдоль ограды, тянется корпус келий, сооруженный в 1889 году Иннокентием Котельниковым, с домовым храмом преподобного Серафима Саровского, построенным в первой половине 1990-х годов. В южной и восточной частях монастырской усадьбы также находятся несколько хозяйственных строений.