После освящения храма Рождества Христова преподобный Серафим обратился к М.В. Мантурову с замечанием: "Мы с тобой, батюшка, храм в честь Рождества Спасителя построили, а церкви в честь Богородицы у нас нет! Царица Небесная на меня, убогого Серафима, прогневалась и сказала: 'Сына Моего почтил, а Меня забыл!' Поэтому я подумал, батюшка, не сделать ли нам еще одну церковь под храмом? Постарайся, батюшка, и у нас будет две церкви". Преподобный дал нитку для измерения, сказав, что если подкоп под храмом Рождества Христова совпадет с меркой, то там и следует строить храм в честь Рождества Богоматери. Подкоп оказался точным, но потолок был низким и требовал опорных столбов, а церковь получалась маленькой. Мантуров обратился за советом к Серафиму, который, преисполненный радостью, воскликнул: "Четыре столба, это значит, что здесь будут покоиться мощи! Это будет усыпальница мощей, батюшка!" В 2000 году здесь действительно была устроена усыпальница для мощей святых жен Дивеевских Александры, Марфы и Елены.

Строительство церкви во имя Рождества Богородицы завершилось летом 1830 года. 8 сентября храм освятил архимандрит Иоаким из Благовещенского монастыря, приехавший в Дивеево, несмотря на эпидемию холеры. Иконостас в церкви был одноярусным, похожим на Христорождественский, но окрашен в зеленый цвет, с Распятием на Царских вратах. Храм был теплым, а пол в нижней церкви украшен разноцветной керамической плиткой, образующей орнамент, напоминающий ковер.

После закрытия монастыря в церкви разместили склад. Повторное освящение нижнего храма состоялось 21 октября 1992 года, а в 1993 году прошел первый после открытия монастыря иноческий постриг.

По заповеди преподобного Серафима в церкви постоянно горит лампада у иконы Рождества Богородицы, и сестры читают неусыпаемую Псалтирь. В 2008 году к церкви пристроили приделы в честь Архангела Михаила и Царственных мучеников. В алтарях нижних приделов устроены могилы Михаила Васильевича Мантурова и духовника дивеевских сестер протоиерея Василия Садовского.

Храм расписан московским художником Константином Охотиным фресками, посвященными земной жизни Пресвятой Богородицы и истории Дивеевской обители. Приделы расписаны художниками нижегородской мастерской "Ковчег".