Собор Николая Чудотворца старше самого города, так как был построен в 1766 году, тогда как статус города Мышкин получил лишь в 1777 году. С этого момента Никольский собор стал городским. Удивительно, что в небольшом селе, которое тогда ещё не имело статуса города, появилось такое крупное каменное здание, и всего за три года.

История строительства собора весьма интересна. Александр Петрович Березин, купец первой гильдии и городской голова Санкт-Петербурга, родился в крестьянской семье в селе Еремейцево, неподалеку от Мышкина. Его отец был настолько беден, что был вынужден заложить икону Святого Николая Чудотворца в местном трактире. Через более чем двадцать пять лет, разбогатев, Александр выкупил икону и считал чудом, что она сохранилась. В память об этом Березин построил в Мышкине церковь на свои средства. Он активно занимался благотворительностью и построил три храма: помимо мышкинского, это были Вознесенская церковь в Круглицах (ныне Охотино) и храм в Петербурге.

Никольский собор был построен в 1766-1769 годах, хотя есть данные, что в 1764 году, как приходской храм с престолами в честь князей Бориса и Глеба и Александра Невского. Архитектор здания неизвестен, но существует версия, что проект мог быть разработан П.Я. Паньковым.

Собор выполнен в классическом стиле. Основное пространство здания представляет собой правильный куб. С западной стороны к нему примыкает большая трапезная, рядом с которой когда-то стояла внушительная колокольня. Здание украшает широкий световой барабан с большими округлыми окнами, богато декорированный лепниной и увенчанный куполом с миниатюрной луковичной главкой. Фасады украшены дорическими пилястрами и архивольтами, а окна, скромными симметричными арками. С северной и южной стороны фасады украшены колоннами с треугольными фронтонами.

В XIX веке перед храмом построили часовню в шатровом стиле, средства на которую пожертвовали местные купцы после чудесного спасения императора Александра III при крушении поезда. Однако часовня не сохранилась до наших дней: в советское время её разрушили, а на её месте установили памятник Ленину.

Внутреннее убранство храма появилось в 1777 году. Живописец Трофим Кашинцев и резчики Королёвы, дворовые люди помещиков Кожиных, создали великолепный иконостас. Многие редкие иконы были утрачены в период гонений на церковь.

В 1830-е годы, после строительства нового Успенского собора, Никольский собор значительно перестроили: на южной и северной стенах появились портики с колоннами, изменили купол. В 1860-х годах полностью перестроили колокольню, которая позже была уничтожена.

Судьба Никольского собора в советское время была трагичной. В 1930-е годы здание передали местным органам культуры, колокольню разобрали. В 1934 году собор переоборудовали в учреждение культуры, и 6 ноября того же года здесь отпраздновали годовщину Октябрьской революции. Из-за спешки над сценой не успели убрать два фрагмента резьбы иконостаса. Последняя дискотека в этом здании прошла 18 апреля 2003 года.

2 мая 2003 года собор вернули РПЦ. Летом того же года выяснилось, что выступающая часть сцены была сделана из икон иконостаса. Сохранились также две боковые панели, одна из которых на протяжении 96 лет хранила икону Спасителя «в терновом венце...». 27 марта 2004 года в соборе нашли закладную плиту, установленную 1 сентября 1835 года. С 2004 года в Никольском соборе возобновились службы.

В соборе проведены масштабные реставрационные работы. В 2010 году Патриарх Московский Кирилл посетил храм в рамках поездки по Ярославской епархии в честь 1000-летия Ярославля. Он пожелал Божией помощи всем, кто участвует в восстановлении собора, и подарил храму икону святого проповедника Ионы Киевского. Сегодня Никольский храм в Мышкине является действующим, но его интерьеры всё ещё нуждаются в восстановлении.