Успенско-Николаевский собор является самым старым каменным храмом, сохранившимся на территории Белгородской области. Согласно данным из «Описания Курского наместничества», составленного Иваном Башиловым в 1785 году, его строительство велось в период с 1692 по 1703 годы. Собор возводился усилиями солдат Белгородского гарнизона и московских стрельцов под руководством Ивана Прокофьева.

В алтаре собора, до его закрытия, находилась записка, свидетельствующая о том, что 15 июля 1701 года Петр I выделил сто рублей на строительство каменной церкви Успения Пресвятой Богородицы и Великого чудотворца Николая в Белгороде. В 1759 году собор сильно пострадал от пожара: были уничтожены деревянная крыша, купола и иконостас, а также пострадали стены. В начале XIX века вокруг собора возвели высокую кирпичную ограду.

В 1889 году на месте северо-западной башни построили круглую часовню в память о спасении императора Александра III и его семьи при крушении поезда 17 октября 1887 года. В начале 1930-х годов собор был закрыт и переоборудован под хлебозавод.

В 1986 году храм был взят под государственную охрану как памятник архитектуры XVII века. В 1998 году собор передали Белгородской и Старооскольской епархии, а в 1999 году, к Пасхе, он был отдан Марфо-Мариинскому женскому монастырю.

Успенско-Николаевский собор является редким примером храма с асимметричным планом и барочным декором, характерным для поздне-московского зодчества. Он трехпрестольный: главный престол посвящен Успению Пресвятой Богородицы, южный придел, Святителю Николаю, архиепископу Мир Ликийских, Чудотворцу, а в северной части трапезной устроен алтарь в честь Святого Иоанна Крестителя. В настоящее время в храме ведутся реставрационные работы.