В 1567 году началась закладка Вологодского кремля, в рамках которой планировалось строительство нового кафедрального храма на месте деревянного собора Воскресения, который оказался за пределами нового городского центра. В 1568 году по указу Ивана Грозного началось возведение каменного собора на берегу реки Вологды. Летописи сообщают, что царь повелел построить соборную церковь Софийскую во имя Успения Пресвятой Богородицы внутри города, у архиерейского дома. Однако, по другим данным, Архиерейский двор был перенесён позже, уже к строящемуся собору. Археологические раскопки 2000 года выявили в этом районе постройки, датируемые 1560-1570-ми годами.

Архитектурным образцом для собора стал Успенский собор в Москве, так как Иван Грозный хотел видеть в своей северной резиденции подобие московского храма. Царь лично следил за строительством и часто останавливался в Вологде. В 1570 году, после завершения основных работ, он посетил собор, но вскоре покинул город, и строительство было заброшено.

Собор оставался недостроенным до 1587 года, когда при царе Фёдоре Иоанновиче его начали достраивать. Завершён был только южный придел, а средняя часть храма достраивалась позже. Южный придел был освящён в 1587 году епископом Антонием во имя Усекновения главы Иоанна Предтечи, святого покровителя Ивана Грозного. Придел находился в дьяконнике собора до капитального ремонта в 1848-1850 годах.

В 1612 году, когда Вологду захватили польские и литовские войска, собор был разгромлен и повреждён пожаром. После ухода захватчиков начались восстановительные работы, и в 1612-1613 годах собор был повторно освящён. В 1639 году Михаил Фёдорович подарил собору медное паникадило, а позже были приобретены ещё три паникадила в Архангельске.

В 1686-1688 годах собор расписали ярославские иконописцы под руководством Дмитрия Григорьева. Перед росписью были расширены окна и прорублены окошки в апсидах. В 1698 и 1724 годах собор пострадал от пожаров, после чего в 1737-1744 годах был установлен новый иконостас.

До 1776 года богослужения в соборе проводились круглый год. Во время ремонта 1848-1851 годов были пристроены каменные притворы, расширены оконные проёмы и покрашена крыша. В 1860-х годах вокруг собора появилась каменная ограда.

Собор посещали императоры: Пётр I в 1724 году, Александр I в 1824 году и Александр II в 1858 году. В 1923 году собор закрыли и передали краеведческому музею, где разместили экспозицию по истории религии и атеизма. С 1935 года собор является памятником федерального значения.

В 1966-1968 годах под руководством архитектора В.С. Баниге проводились реставрационные работы, в ходе которых собору вернули облик XVII века. Внутри храма закрепляли старинные фрески под руководством Н.В. Перцева.

С 1999 по 2007 год прошла комплексная реставрация собора. Сейчас он находится под управлением Вологодского государственного музея-заповедника и открыт для посещения летом. В некоторые церковные праздники в соборе проходят службы. В июне 2007 года Патриарх Алексий II совершил в соборе торжественную литургию.