Первый Успенский храм в Одессе появился через 20 лет после основания города. Небольшая старообрядческая часовня была освящена 7 июля 1814 года. В 1845 году был утвержден план строительства трехпрестольного Свято-Успенского храма, а спустя 8 лет, в 1853 году, сюда впервые принесли одну из главных святынь юга царской России, чудотворную «Касперовскую» икону Божьей Матери. В 1854 году эта икона защитила город от англо-франко-турецкого флота, который вошел в одесский залив.

17 июля 1855 года святитель Иннокентий заложил новый трехпрестольный Успенский храм на Преображенской улице. Основные средства на строительство предоставили одесские купцы Черепенниковы, а архитектором стал Л. Оттон.

Строительство храма длилось 14 лет, и 12 апреля 1869 года архиепископ Херсонский и Одесский Димитрий освятил здание собора.

19 января 1875 года архиепископ Херсонский и Одесский Леонтий освятил главный придел нижнего единоверческого храма во имя святителя и чудотворца Николая, покровителя моряков и путешественников, а 30 января, второй придел, во имя Трех Святителей: Василия Великого, Григория Богослова и Иоанна Златоуста. Позже жители Москвы пожертвовали для нижнего храма Одесской Свято-Успенской церкви иконы и богослужебную утварь.

В нижнем храме Свято-Успенского кафедрального собора находятся мощи праведного Ионы, который, по словам современников, проявлял множество различных образов святости. Отец Иона обладал даром пророчества и исцеления душевных и телесных недугов. Крест, которым он освящал воду, до сих пор хранится в соборе и является одной из наиболее почитаемых святынь.

В Свято-Успенском кафедральном соборе Одессы также находится икона святителя Иннокентия с частицей его мощей.

С приходом большевиков Успенскому собору, как и другим храмам города, пришлось нелегко. Храм был закрыт в конце 30-х годов XX века.

В 1942 году румынские оккупанты возобновили деятельность нижнего храма, для чего им пришлось несколько дней откачивать из него воду, так как он был затоплен на 1,5 метра. Во время Великой Отечественной войны верхний храм пострадал больше нижнего, в центральный купол попала немецкая бомба. Тем не менее, 56-метровая колокольня храма стала символом борьбы одесситов с фашистскими оккупантами. Одна из историй рассказывает, что однажды ночью советские подпольщики подняли на колокольню красный флаг, который румынам удалось снять только на следующий вечер. Об этом событии когда-то напоминала мемориальная доска на стене храма.

Восстановление храма после войны стало возможным благодаря усилиям архиепископа Никона, митрополита Бориса и патриарха Алексия I Симанского.

В 2008 году по инициативе и благословению митрополита Одесского и Измаильского Агафангела был проведен капитальный ремонт здания, усовершенствована система отопления, а храм украсили новыми настенными росписями. Проектировщиками росписей Верхнего храма стали Владимир Борисов и Ростислав Антонов, а сами росписи выполнили художники Виталий и Даниил Хомницкие. Благодаря стараниям Владыки Агафангела была благоустроена воскресная школа. В 2010 году по его благословению был позолочен купол над колокольней, а в 2012 году, главный купол.