Le premier temple de l'Assomption à Odessa est apparu 20 ans après la fondation de la ville. Une petite chapelle vieux-croyante a été consacrée le 7 juillet 1814. En 1845, le plan de construction d'une église à trois autels de l'Assomption a été approuvé, et 8 ans plus tard, en 1853, l'une des principales reliques du sud de la Russie impériale, l'icône miraculeuse de la Mère de Dieu « Kaspérovskaïa », a été apportée ici pour la première fois. En 1854, cette icône a protégé la ville de la flotte anglo-franco-turque qui est entrée dans la baie d'Odessa.

Le 17 juillet 1855, le saint Innocent a posé la première pierre d'un nouveau temple à trois autels de l'Assomption sur la rue Préobrajenskaïa. Les principaux fonds pour la construction ont été fournis par les marchands odessites Tcherépenikov, et l'architecte était L. Otton.

La construction du temple a duré 14 ans, et le 12 avril 1869, l'archevêque de Kherson et d'Odessa, Dimitri, a consacré le bâtiment de la cathédrale.

Le 19 janvier 1875, l'archevêque de Kherson et d'Odessa, Léonty, a consacré le principal autel du temple inférieur unifié au nom du saint et miracle Nicolas, le patron des marins et des voyageurs, et le 30 janvier, le second autel, au nom des Trois Saints : Basile le Grand, Grégoire le Théologien et Jean Chrysostome. Plus tard, les habitants de Moscou ont fait don d'icônes et de vases liturgiques pour le temple inférieur de l'église de l'Assomption d'Odessa.

Dans le temple inférieur de la cathédrale de l'Assomption se trouvent les reliques du juste Ion, qui, selon ses contemporains, manifestait de nombreuses formes de sainteté. Le père Ion avait le don de prophétie et de guérison des maladies de l'âme et du corps. La croix avec laquelle il consacrait l'eau est toujours conservée dans la cathédrale et est l'une des reliques les plus vénérées.

Dans la cathédrale de l'Assomption d'Odessa se trouve également une icône du saint Innocent avec une parcelle de ses reliques.

Avec l'arrivée des bolcheviks, la cathédrale de l'Assomption, comme d'autres églises de la ville, a connu des difficultés. Le temple a été fermé à la fin des années 30 du XXe siècle.

En 1942, les occupants roumains ont repris les activités du temple inférieur, pour cela ils ont dû pomper l'eau pendant plusieurs jours, car il était inondé de 1,5 mètre. Pendant la Grande Guerre patriotique, le temple supérieur a été plus endommagé que le inférieur, une bombe allemande a touché le dôme central. Néanmoins, le clocher de 56 mètres de l'église est devenu le symbole de la lutte des odessites contre les occupants fascistes. Une des histoires raconte qu'une nuit, des partisans soviétiques ont hissé un drapeau rouge sur le clocher, que les Roumains n'ont pu enlever que le soir suivant. Cet événement était autrefois commémoré par une plaque commémorative sur le mur de l'église.

La restauration de l'église après la guerre a été rendue possible grâce aux efforts de l'archevêque Nikon, du métropolite Boris et du patriarche Alexis I Simanski.

En 2008, à l'initiative et avec la bénédiction du métropolite d'Odessa et d'Izmaïl Agafangel, des travaux de rénovation majeurs ont été réalisés sur le bâtiment, le système de chauffage a été amélioré, et l'église a été ornée de nouvelles fresques murales. Les concepteurs des fresques du temple supérieur étaient Vladimir Borisov et Rostislav Antonov, et les fresques elles-mêmes ont été réalisées par les artistes Vitaly et Daniil Khomnitsky. Grâce aux efforts de l'archimandrite Agafangel, l'école du dimanche a été aménagée. En 2010, avec sa bénédiction, le dôme au-dessus du clocher a été doré, et en 2012, le dôme principal.