В 1799 году началось строительство однопрестольной каменной церкви во имя Рождества Богородицы, завершенное в 1800 году на средства российских купцов. Из-за этого ее также называли «Старокупеческой». Возведением церкви руководил протоиерей Карп Павловский. Высота храма составляет 38 метров, а его стены выполнены из тесаного камня-ракушняка. Первоначально колонны были позолочены. В 1828 году к главному приделу в честь Рождества Пресвятой Богородицы добавили два новых: левый, посвященный святым царям Константину и Елене, и правый, в честь святителя Митрофана, епископа Воронежского. В этом же году церковь получила статус Собора. В 1835 году, когда решался вопрос о названии улицы, на которой находится Собор, Г.Г. Автономов предложил адмиралу М.П. Лазареву назвать ее Рождественской в честь Собора Рождественско-Богородичного.

При соборе в 1874 году было создано церковно-приходское попечительство, почетным членом которого в начале XX века стал настоятель Кронштадтского собора протоиерей Иоанн Сергиев, ныне известный как святой праведный Иоанн Кронштадтский.

Храм расположен в исторической части Николаева, известной как «Городовой», на пересечении улиц Рождественской Лягина и Купеческой Потемкинской. В 1922 году, во время изъятия церковных ценностей для помощи голодающим, община собора передала 172 кг серебра. 31 января 1930 года власти сняли колокола весом 10,2 тонны цветного металла, а 8 ноября 1936 года собор был закрыт. В предвоенные годы здание использовали как гарнизонный Дом Красной Армии и Флота, а после войны оно стало «Домом офицеров».

В начале 90-х годов собор был передан Украинской Православной Церкви Московского Патриархата и с тех пор стал любимым местом для многих горожан. В нем хранятся мощи священномученика Сергия, пострадавшего за веру, а также частица мощей святого праведного Феодора Ушакова.