Барочная Свято-Никольская церковь считается одной из самых почитаемых среди прихожан, так как за свою трёхвековую историю она закрывалась лишь на три года. Храм устоял во время немецкой оккупации и боёв за освобождение города. Его деревянный предшественник имел важное значение для государства и политики, так как в то время было необходимо положить конец Смуте и слухам о спасении царевича Дмитрия. В храме находилось множество икон погибшего царевича, и его часто поминали. Церковь была построена за государственный счёт по указу Михаила Фёдоровича, который подарил храму значительные земельные угодья. Однако деревянная церковь сгорела в 1703 году, как и многие другие постройки того времени. После взятия Петром I Азова кораблестроение на реке Воронеж пришло в упадок, и город покинули иностранные специалисты. В начале XVIII века в город прибыло множество чиновников, военных и жителей азовских территорий, переданных противнику, и они нуждались в храмах. Святитель Митрофан распорядился построить рядом с местом сгоревшего Димитриевского храма новую каменную церковь, третью в Воронеже. За пять лет собрали средства и нашли мастеров, и к 1720 году строительство было завершено. Новый храм освятили в честь святителя Николая, архиепископа Мир Ликийских.

В мае 1748 года церковь пережила сильный пожар, но устояла, хотя и потеряла большую часть внутреннего убранства. Здание отремонтировали, добавив придел в честь великомученика Димитрия Солунского, а позже пристроили колокольню. В 1831 году Воронеж пострадал от эпидемии холеры, унесшей жизни каждого шестого жителя. Эпидемия быстро прекратилась, и горожане связывали это с молебнами в Никольском храме перед иконой Божией Матери Толгская. После этого икону носили по улицам города, и верующие исцелялись. В честь этой иконы в храме обустроили новый придел. С 1881 года при храме действовало церковноприходское попечительство, хотя причт был небольшим: священник, дьякон и псаломщик. Известно, что перед революцией 1917 года здесь служил священник Фёдор Лукин. Члены причта жили рядом с храмом в церковных домах. Несмотря на малочисленность, причт активно помогал в годы Русско-японской и Первой мировой войн, проводя молебны за победу русского оружия и собирая пожертвования для армии и семей погибших и раненых.

В советское время кафедра обновленческих архиереев Воронежа находилась в Благовещенском соборе Митрофановского монастыря, а затем переместилась в Никольский храм. Прихожане требовали возвращения храма в лоно истинной Церкви. Вскоре большевики разочаровались в обновленческом движении, и храм был закрыт, но ненадолго. Во время Великой Отечественной войны двери Никольской церкви первыми среди воронежских храмов вновь открылись для верующих в 1942 году. После освобождения Воронежа богослужения возобновились и с мая 1943 года не прекращались.