Die barocke Nikolauskirche gilt als eine der am meisten verehrten unter den Gläubigen, da sie in ihrer dreihundertjährigen Geschichte nur drei Jahre geschlossen war. Der Tempel hielt während der deutschen Besatzung und der Kämpfe um die Befreiung der Stadt stand. Ihr hölzernes Vorgängergebäude hatte eine wichtige Bedeutung für den Staat und die Politik, da es notwendig war, das Zeit der Wirren und die Gerüchte über die Rettung des Zarewitsch Dmitri zu beenden. In der Kirche befanden sich viele Ikonen des verstorbenen Zarewitsch, und er wurde oft erinnert. Die Kirche wurde auf Staatskosten auf Anordnung von Michael Fedorovich erbaut, der der Kirche bedeutende Ländereien schenkte. Doch die Holzkirche brannte 1703 nieder, wie viele andere Gebäude dieser Zeit. Nach der Einnahme von Asow durch Peter I. kam der Schiffbau am Fluss Woronesch zum Erliegen, und ausländische Fachkräfte verließen die Stadt. Zu Beginn des 18. Jahrhunderts kamen viele Beamte, Militärs und Bewohner der an den Feind abgetretenen asowischen Gebiete in die Stadt, und sie benötigten Kirchen. Der Heilige Mitrophan ordnete den Bau einer neuen Steinkirche in der Nähe des Ortes der niedergebrannten Dimitrievskaja-Kirche an, der dritten in Woronesch. In fünf Jahren wurden Mittel gesammelt und Meister gefunden, und bis 1720 war der Bau abgeschlossen. Der neue Tempel wurde zu Ehren des Heiligen Nikolaus, Erzbischof von Myra in Lykien, geweiht.

Im Mai 1748 überstand die Kirche ein starkes Feuer, hielt jedoch stand, obwohl sie einen Großteil ihrer inneren Ausstattung verlor. Das Gebäude wurde repariert, und eine Kapelle zu Ehren des heiligen Märtyrers Dimitri von Thessaloniki wurde hinzugefügt, später wurde ein Glockenturm angebaut. 1831 litt Woronesch unter einer Choleraepidemie, die das Leben eines von sechs Einwohnern forderte. Die Epidemie endete schnell, und die Stadtbewohner verbanden dies mit den Gebeten in der Nikolauskirche vor dem Bild der Gottesmutter von Tolga. Danach wurde das Ikone durch die Straßen der Stadt getragen, und die Gläubigen wurden geheilt. Zu Ehren dieses Ikone wurde in der Kirche eine neue Kapelle eingerichtet. Seit 1881 gab es in der Kirche eine kirchliche Gemeinde, obwohl das Personal klein war: ein Priester, ein Diakon und ein Psalmodist. Es ist bekannt, dass vor der Revolution von 1917 hier der Priester Fjodor Lukin diente. Die Mitglieder des Klerus lebten in der Nähe der Kirche in kirchlichen Häusern. Trotz ihrer geringen Zahl half die Gemeinde aktiv in den Jahren des Russisch-Japanischen und des Ersten Weltkriegs, indem sie Gebete für den Sieg der russischen Waffen abhielt und Spenden für die Armee und die Familien der Gefallenen und Verwundeten sammelte.

In der Sowjetzeit befand sich der Stuhl der reformistischen Bischöfe von Woronesch in der Blagoweschtschenskij-Kathedrale des Mitrophanov-Klosters und wurde dann in die Nikolauskirche verlegt. Die Gläubigen forderten die Rückkehr der Kirche in den Schoß der wahren Kirche. Bald waren die Bolschewiki von der reformistischen Bewegung enttäuscht, und die Kirche wurde geschlossen, jedoch nicht für lange. Während des Großen Vaterländischen Krieges öffneten die Türen der Nikolauskirche als erste unter den Woronescher Kirchen 1942 wieder für die Gläubigen. Nach der Befreiung von Woronesch wurden die Gottesdienste wieder aufgenommen und wurden seit Mai 1943 nicht mehr unterbrochen.