Никольская церковь, позже переименованная в Успенскую, была возведена в 1692 году на территории посада. Сейчас это угол Советской улицы и переулка Федина, где находятся сквер и здание сызранского городского суда. В 1752 году на месте деревянной церкви была построена красивая каменная. По преданию, её возвёл сызранский купец Ротков, хотя документальных подтверждений этому нет.

Успенская церковь была известна в городе благодаря ежегодному крестному ходу, который совершался в неё из всех церквей Сызрани в день Успения Божией Матери. Эта традиция началась в 1830 году, когда в Сызрани свирепствовала холера. Горожане собрались на общее моление об избавлении от болезни, и их молитва была услышана, недуг отступил в день Успения Божией Матери. В благодарность за это было установлено ежегодное торжественное шествие в Успенскую церковь.

В 1930-х годах церковь была закрыта и разрушена. Восстановить её на историческом месте оказалось невозможным из-за городских построек. Было решено возродить храм в Заусиновском овраге, где в 1930-е годы хоронили расстрелянных политических заключённых. По благословению протоиерея Григория Коберника началось проектирование. 2 ноября 2001 года в фундамент была заложена капсула с названием будущей церкви и датой начала строительства. В 2003 году архиепископ Самарский и Сызранский Сергий совершил чин основания храма.

Храм был построен к 2004 году на средства завода «Тяжмаш» и 28 августа, в день Успения Божией Матери, принял первых прихожан. В 2005 году на пожертвования была построена крестильня, а в 2006 году установлен поклонный крест в память о жертвах 1930-х годов. В октябре 2011 года школьники заложили "Аллею памяти" жертв политических репрессий, посадив 15 деревьев в Заусиновском овраге. 28 августа 2012 года, в день Успения Пресвятой Богородицы, было освящено новое двухэтажное здание воскресной школы.