В писцовых книгах Ново-Александровой слободы 1675 года упоминается девичий монастырь Успения Пресвятой Богородицы, расположенный в городе. На территории монастыря находится каменная церковь Успения Пресвятой Богородицы с трапезной и пределом Марии Египетской. Справа от южного входа в монастырь расположена небольшая Успенская церковь, давшая название всему монастырю. Она была построена в начале XVI века или, по другой версии, в 1570-х годах и служила домовой церковью великокняжеской семьи. В церкви, помимо основного престола в честь Успения Божией Матери, были два придела: северный, Николая Чудотворца и южный, Иоанна Крестителя. Построенная из белого камня и кирпича, церковь изначально была четырехстолпной, одноглавой и трехапсидной, возвышаясь на высоком подклете с белокаменными погребами. Открытые галереи, окружавшие церковь, во второй половине XVI века были заложены кирпичом. Сейчас это пятиглавый храм, с глухими главками без окон, украшенными крестами с венцами. Облик церкви изменился из-за четырехскатной крыши, вероятно, добавленной в XVIII веке. Колокольня храма невысокая, шатер установлен на четверике с открытой аркадой. Двухъярусные каменные паперти частично восстановлены архитектором Н.В. Сибиряковым. В интерьере церкви сохранились резные белокаменные порталы, южный из которых полностью раскрыт, а северный, частично. Западный портал, вероятно, был изменен при перестройке.

В начале XVII века, в период Смуты, церковь сильно пострадала и до середины века службы в ней не проводились. В 1651 году по указу царя Алексея Михайловича церковь была передана для устройства девичьей обители. Монастырская летопись сообщает, что старицы Анисия и Феодора очистили церковь и восстановили иконы. На пожертвованные царицей Марией Ильиничной средства храм был украшен и освящен 15 августа 1654 года. В 1663-1666 годах, при старце Корнилии, церковь была значительно перестроена: своды переложены, два западных столба разобраны, а вместо одной главы появились пять. С запада пристроили трапезную с хлебной и поварней, а позже, каменную колокольню с восемью колоколами и часами. Также была построена двухэтажная сводчатая палата. Работы выполняли мастера, присланные царем Алексеем Михайловичем и царицей Марией Ильиничной. Придел Николая Чудотворца был освящен в честь Марии Египетской. В 1667 году храм был заново освящен, о чем свидетельствует надпись на кресте.

В 1743 году заменили крыши и обновили главы церкви. В 1755 году укрепили своды. В XIX веке окна церкви заменили на стеклянные, крыши покрыли железом, а полы, плиткой. Ремонтные работы проводились при игумениях Евгении Ивановой, Елисавете Лавровой и Евфрасии Лихаревой. В 1869 году церковь обновили на средства купцов Полежаева и Зубова. В 1900 году на пожертвование Клавдии Зубовой была окрашена крыша и главы. Успенский храм был теплым и отапливался изразцовыми печами. В нижнем этаже располагались квасоварня и просфорня. В храме находились две чудотворные иконы Божией Матери, одна из которых хранится в музее, а другая, в Троицком соборе. Привезенная из Иерусалима икона Успения Божией Матери была украшена и помещена над царскими вратами. Особой святыней был позолоченный ковчег с мощами святых.

В феврале 1923 года монастырь был закрыт, но прихожане зарегистрировали религиозную общину и продолжали службы в церкви. Однако вскоре храм передали Александровскому музею. В 1927 году В.П. Зубов описывал храм как заброшенный и закрытый для осмотров. В настоящее время Успенская церковь находится под управлением музея-заповедника «Александровская слобода».