Храм, находящийся на третьем этаже семинарии, был расписан московским художником Чередниковым с помощниками и известным оренбургским художником Лукианом Поповым. На стенах изображены святители в полный рост. Над аркой напротив алтаря изображён торжественный Вход Господа Иисуса Христа в Иерусалим. 26 августа 1884 года храм, посвящённый трём святителям: Василию Великому, Григорию Богослову и Иоанну Златоусту, был освящён епископом Вениамином II, который провёл в нём первую Литургию. В учебную церковь поступило множество пожертвований. Один из благотворителей, пожелавший остаться неизвестным, подарил на икону Богородицы серебряную ризу с золотым венцом, украшенным семью камнями: тремя бриллиантами и тремя розовыми рубинами. Он также пожертвовал колокол весом 20 пудов. Игуменья Оренбургского Успенского монастыря Таисия подарила серебряный потир, а смотритель духовного училища Николай Сперанский, аналой с вышитым покрывалом. Священник оренбургской Троицкой церкви Иоанн Разсыпнинский, служивший в войсковом Георгиевском соборе и Покровской церкви села Ташла, передал несколько икон. Трёхсвятительская церковь получила множество других пожертвований от своих благотворителей.

Учебный год 1917-1918 стал последним для семинарии, так как здание заняли части Красной армии. Позже здесь разместилось Чкаловское лётное училище, переведённое из Серпухова, а с 1995 года, муниципальный кадетский корпус имени И.И. Неплюева. Благодаря усилиям митрополита Оренбургского и Бузулукского Валентина, часть здания семинарии была возвращена епархии по решению Оренбургского горсовета от 15 июня 2007 года. После реставрации в нём открылась Оренбургская духовная семинария. Исчезнувшие росписи храма восстановили по оригинальным эскизам, сохранившимся в Российском государственном историческом архиве. Для росписи восстановленного храма пригласили мастеров Палехской иконописной мастерской «Лик» из поселка Палех Ивановской области. Руководитель группы художников Олег Романович Шуркус перед началом работ посетил Афон. В марте 2010 года иконописцы начали роспись с потолка трапезной, в сентябре приступили к центральной части, а с марта 2011 года завершили работы в притворе.

В алтаре церкви находится старинная икона «Моление о чаше», созданная известным русским художником Владимиром Егоровичем Маковским, переданная из Покровского собора. Ранее она находилась в оренбургском Казанско-Богородицком соборе. Также здесь есть Казанская икона Божией Матери в металлической ризе и икона святителя Николая Чудотворца, написанная орским иконописцем протоиереем Сергием Барановым, переданная епископом Орским и Гайским Иринеем.

Вся деятельность семинарии сосредоточена вокруг храма, который является её сердцем. Здесь ежедневно проходят уставные богослужения и чтение молитвенных правил для студентов. Каждый желающий может прийти сюда для молитвы. В 2014 году семинария отметила 130-летие со дня своего основания.