Впервые деревянный храм упоминается в писцовых книгах 1629 года как церковь Великомученика Никиты и Святителя Алексия. Иногда к названию добавляли уточнения, такие как «что у Дедиловских ворот» или «что на посаде». В XVIII веке она называлась церковью великомученика Никиты, «что слывет старою», в отличие от Новоникитской, или Сретенской церкви на углу современных улиц Металлистов и Советской. К середине XVIII века храм обветшал, и были перестроены трапезная, колокольня и придел Алексия митрополита. В 1758 году купец Иван Фомич Лугинин добавил придел во имя священномученика Харлампия. В 1779 году церковь была отремонтирована и освящена в 1789 году. В 1820 году одноэтажную Староникитскую церковь разобрали и построили заново в два этажа. Нижний храм освятили в 1821 году, верхний, в 1827 году во имя иконы Божией Матери «Живоносный Источник». В 1850-1851 годах, благодаря стараниям церковного старосты А. И. Жданова, был изготовлен новый иконостас. В 1852 году по завещанию купца Михаила Ивановича Струкова в трапезной на втором этаже построили придел во имя Архистратига Михаила. Колокольня, построенная в 1755 году, через сто лет лишилась позолоты. В 1863 году, благодаря усилиям церковного старосты Михаила Михайловича Струкова и прихожан, позолоту восстановили. На колокольне было 7 колоколов, а иконостасы верхнего и нижнего храма были позолочены на средства М. М. Струкова и других купцов. Из всех образов церкви наиболее почитаемой была икона Божией Матери «Живоносный Источник», известная своими чудесами. В начале XIX века она находилась в доме купцов Лугининых, а затем мещан Ивана и Петра Лугининых. Одно из чудес, исцеление от слепоты купца Якова Бабаева. Перед смертью Агриппина Лугинина завещала передать икону в Староникитскую церковь, что и было сделано в 1818 году. Икону часто носили по домам горожан, а в праздники храм был переполнен. Поэтому, когда церковь стала двухэтажной, верхний храм освятили во имя этой иконы.

В 1894 году при храме открыли церковноприходскую школу. Изначально она располагалась в доме, купленном за 950 рублей у наследников протоиерея Любомудрова, но здание было ветхим. В 1902 году решили построить новое здание для школы, и через два года оно было готово. В 1903 году в ночь на праздник великомученика Никиты в церкви произошел пожар, уничтоживший иконостас и купол. На восстановление требовалось более тысячи рублей, которых не было. Член попечительства Н. А. Зубарев, с согласия своего хозяина, предоставил необходимое железо для ремонта. Храм дал название двум тульским улицам: Никитской и Староникитской.

Храм был закрыт 16 февраля 1930 года по решению президиума Мособлисполкома. Первоначально планировалось использовать его под школу, но здание передали Тульскому механическому институту для лабораторий и мастерских. Эти лаборатории находились в здании почти 65 лет. Позже здание использовалось подразделением Института физики Земли. В 1991 году храм был признан памятником истории и культуры регионального значения. В 1994 году в газете «Молодой коммунар» была опубликована статья о выдворении арендаторов из здания. В освободившихся помещениях разместился театр-студия «У Толстовской заставы». Планировалось открыть выставочный зал и школу иконописи, но эти планы не осуществились. В 1995 году рухнуло чугунное крыльцо, а в 1998 году произошел пожар, разрушивший здание. Ремонт не проводился, и здание постепенно разрушается. Никитская церковь входит в состав казны города Тула, но не может быть отреставрирована за счет бюджета, так как является имуществом религиозного назначения.