Самый древний храм в Новгороде и один из первых на Руси, посвященный св. мученикам Борису и Глебу, был основан в 1146 году на месте, где ранее стоял деревянный Софийский храм с 13 верхами. В 1167 году деревянную церковь заменили на каменную, которую освятили в 1171 году.

Летописи упоминают, что храм был "великолепен и красив". Он неоднократно горел, разрушался и перестраивался. В 1405 году пожар уничтожил его полностью, а в 1411 году архиепископ Евфимий возвел новую церковь Бориса и Глеба на старом фундаменте. Окончательно храм был разобран во второй половине XVII века, и на его месте в Кремле теперь стоит церковь Андрея Стратилата.

До наших дней дошла только церковь Бориса и Глеба в Плотниках. Ее история известна из летописей, описаний новгородских древностей архимандрита Макария и современных исследований. Первое упоминание о каменном одноглавом храме Бориса и Глеба относится к 1377 году. Храм не раз страдал от пожаров и в итоге был разобран из-за ветхости.

В 1536 году началось строительство нового каменного пятиглавого храма с двумя приделами, посвященными святому Николаю Чудотворцу и святому Владимиру. В строительстве участвовали жители двух улиц, Запольской и Конюховой, а также московские и новгородские гости. Церковь была возведена за пять месяцев и освящена в 1537 году. В строительстве участвовали тридцать человек, из которых двадцать были мастерами. В XVI веке церковь считалась соборной, а в XVII веке, ружной. На день Бориса и Глеба в XVII веке в церкви проводилась архиерейская служба.

Собор сохранил свои первоначальные архитектурные формы и представляет собой четырехстолпную кубическую постройку с одной полукруглой апсидой и пониженным западным притвором, завершенную пятью главами. Фасады разделены лопатками на три прясла. Архитектурное решение типично для новгородской архитектуры республиканского времени. Пять глав, устройство подклета, многощипцовое завершение фасадов и фризы из пятиугольных ниш, все это новые веяния в архитектуре. Церковь Бориса и Глеба двухэтажная с одной алтарной апсидой и пристройкой с западной стороны. В XVIII веке южный придел св. Николая Чудотворца был перенесен в западный притвор, а придел св. Владимира, в подцерковье. Тогда же впервые упоминается Покровский придел в северной части притвора. Из иконостаса церкви сохранились некоторые иконы, которые сейчас находятся в Новгородском музее.

К началу XX века церковь пришла в запустение и считалась одной из беднейших в империи. После 1907 года она была отремонтирована, и архитектор В. В. Суслов впервые сделал обмеры храма XVI века. В апреле 1933 года церковь была закрыта. В 1950-е годы под руководством З. И. Васильевой проводились реставрационные работы, а в 1960-е и 1980-е годы исследования и реставрацию продолжили Т. В. Гладенко и В. А. Попов. В 1992 году церковь была передана Новгородской епархии и освящена 6 августа того же года.