Посвящение храма святому Александру Невскому связано с чудесным спасением императора Александра II после покушения народовольцев в 1866 году. Изначально церковь была посвящена Николаю Чудотворцу, что связано с пребыванием в Вологде в 1556 году иконы Николая Чудотворца Великорецкого.

До 1869 года главный престол церкви был освящён в честь Николая Чудотворца. Строительство первоначальной церкви связано с прибытием в Вологду в 1556 году списка Великорецкой иконы Николая Чудотворца. Эту икону, происходящую с Вятки, по приказу Ивана Грозного в 1555 году доставили в Москву для обновления, пронеся крестным ходом по рекам Вятке, Каме, Волге, Оке и Москве. В Москве икону торжественно встретили, сделали её список и заложили придел Николы Великорецкого в строившемся Покровском соборе на Рву. Обратный путь иконы на Вятку в 1556 году проходил через Вологду, Великий Устюг и Сольвычегодск, где в городах и монастырях создавались её списки. Изначально храм Николая Чудотворца в Вологде располагался на Старом торгу напротив Ильинского монастыря. Не позднее 1612 года его перенесли внутрь кремля к Софийскому собору, где строились все последующие здания церкви. Место, где была возведена новая церковь, называлось Известью, позже стало именоваться Известной горой, возможно, из-за запасов извести, хранившихся здесь при строительстве Вологодского кремля.

До конца XVIII века здания церкви Николая Чудотворца были деревянными. В 1627 году это был клетский храм с трапезной. В 1698 году храм упоминается в связи с пожаром, в котором он сгорел вместе со всеми строениями набережной реки Вологды от Вознесенской церкви до Софийского собора. Существующее каменное здание храма построено во второй половине XVIII века, но не позднее 1782 года. В 1811 году главный престол церкви был переосвящён во имя Нерукотворного Образа Господня. В тёплой церкви, трапезной, были освящены придельные престолы: справа, во имя Святого Николая Чудотворца, слева, во имя Преподобного Кирилла Новоезерского. В начале XIX века, из-за новой градостроительной политики, согласно которой в центральных кварталах города предписывалось строить административные учреждения, приход Николаевской церкви на Извести сильно сократился. После 1826 года церковь стала бесприходской и была приписана к кафедральному собору, а прихожан приписали к Покровской церкви. В 1869 году, в память о чудесном спасении императора Александра II, церковь была переосвящена во имя святого Александра Невского. В 1860-е годы храм был отремонтирован и перестроен внутри, шатровая колокольня заменена на существующую, шпилевидную.

После перевода в Вологду в 1910 году 198-го Александро-Невского пехотного полка церковь Александра Невского стала единственным в городе полковым военным храмом.

В 1924 году церковь закрыли. Здание, национализированное, использовалось как общежитие, склад, управление «Главкинопроката» и лыжная база. Во время войны в 1941 и 1945 годах в здании находилась воинская часть. За время советской власти церковь сильно пострадала, был утрачен шпиль колокольни и крест над холодным храмом. В 1978 году церковь Александра Невского была поставлена на государственную охрану как памятник архитектуры регионального значения. После реставрации в 1980-х годах здание церкви передали областному краеведческому музею, а в 1997 году вернули Вологодской епархии. Первым настоятелем возрождённой церкви стал иерей Андрей Пылёв. После восстановительных работ 20 ноября 1997 года, в день памяти преподобного Кирилла Новоезерского, была совершена первая литургия. 6 декабря 1997 года освятили главный престол. Престол Кирилла Новоезерского был возобновлён после обретения иконы святого, которую принесла в храм одна из прихожанок.