Im Jahr 1859 stellte die Stadtverwaltung Orenburg der Frauengemeinschaft kostenlos 10 Desjatinen Land nördlich des christlichen Friedhofs zur Verfügung. Auf diesem Land bauten die Kaufleute Nikolai und Stefan Michailowitsch Deew mehrere Gebäude. Bis 1864 war die Zahl der Schwestern so gestiegen, dass mit dem Bau des ersten massiven Gebäudes, des "weißen" Zellenbaus, begonnen wurde, der 1865 fertiggestellt wurde. Am 17. Februar 1866 wurde die Uspenskaja Frauengemeinschaft offiziell eröffnet, und zu Ehren dieses Ereignisses begann der Bau der Hauskirche des Heiligen Nikolaus, die 1867 geweiht wurde. Am 20. Oktober 1867 erhielt die Gemeinschaft die Erlaubnis für einen eigenen Stempel. Am 9. August 1867 wurde die Oberin der Gemeinschaft, Nonne Tatjana Alexejewna Konnowa, unter dem Namen Taisija tonsuriert. Durch einen Erlass des Heiligen Synods vom 28. September 1872 wurde die Gemeinschaft in Uspenski Kloster umbenannt. Laut anderen Quellen geschah dies am 15. Januar 1874. Am 24. Februar 1874 wurde Nonne Taisija zur Äbtissin erhoben und erhielt den Stab.

Im Jahr 1868 begann der Bau der Hauptkirche der Himmelfahrt der Heiligen Gottesmutter nach dem Entwurf des Architekten K.A. Ton. Die Kirche wurde aus Spenden und Mitteln errichtet, die von den Orenburger Nonnen in ganz Russland gesammelt wurden. Der erste Altar wurde am 14. September 1875 geweiht, der letzte am 30. September 1884. Im Jahr 1885 begann der Bau des fünfstöckigen Glockenturms, der 1888 abgeschlossen wurde. Im zweiten Stock wurde 1893 eine Kirche zu Ehren des Iweron-Ikone der Gottesmutter eingerichtet, und am 12. September 1906 wurden auf Initiative und mit Mitteln des Hieromönchs Witalij Turmuhr installiert. Die erste Äbtissin Taisija, die 1891 starb, gilt als Gründerin des Klosters, und ihre Nachfolgerin Äbtissin Innokentija als Baumeisterin. Ihre Arbeit wurde mit Auszeichnungen gewürdigt, darunter das Goldene Brustkreuz mit Schmuck, das am 6. Mai 1912 verliehen wurde.

Nach der Revolution, in den 1920er Jahren, wurden die Gebäude des Klosters von GUBON und FAKT für die Unterbringung von Waisenhäusern, einem Medizintechnik-Institut, Werkstätten, Schulen, einem Kinderstadt und einer Parteischule genutzt. Ab November 1926 wurden alle Gebäude an die Militärschule für Luftkampf zur Unterbringung von Familien von Piloten vermietet. Die Kirchengebäude und die steinerne Umfriedung wurden abgerissen, die Familiengräber und Gräber des Friedhofs, auf denen lange Zeit Militärfahrzeuge standen, wurden zerstört. Von den Fliedergärten blieben nur einzelne Büsche übrig. Auf dem Gelände wurden steinerne Produktions- und Wohngebäude errichtet. Im Jahr 1998 wurden im Zusammenhang mit dem Bau eines mehrstöckigen Wohnhauses die Gebäude des Viehstalls und das steinerne Nebengebäude abgerissen.

Im nachkriegszeitlichen sowjetischen Zeitraum stand das Gebiet des Klosters unter der Verwaltung des Verteidigungsministeriums der RF. Erst im Jahr 2010, nach langen Anfragen der Russisch-Orthodoxen Kirche, wurde das Gebäude der Klosterkantine zurückgegeben. Mit dem Segen von Metropolit Valentin kümmerte sich Nonne Flora seit Dezember 2006 um die Dokumentation und Verhandlungen mit "Rosimuschestwo" und dem Verteidigungsministerium über die Rückgabe der Gebäude und Grundstücke, die dem Heiligen Uspenski Orenburger Frauenkloster gehörten. Im August 2010 wurde das Gebäude der Kantine zurückgegeben.