Семья Третьяковых приобрела дом в Лаврушинском переулке в 1851 году, хотя история этого владения начинается еще в конце XVII века. Уже тогда здесь стояли каменные палаты, которые неоднократно перестраивались, в том числе при Кологривовых в XVIII веке. В 1835-1839 годах купцы Шестовы провели очередную реконструкцию.

Павел Михайлович Третьяков в 1856 году купил первые картины русских художников: «Стычка с финляндскими контрабандистами» Василия Худякова и «Искушение» Николая Шильдера, что стало началом его знаменитой коллекции. Со временем места для растущего собрания стало не хватать, и в 1872 году он пристроил к юго-западному углу дома дополнительный корпус для галереи. В 1880-е годы, по проекту архитектора А. С. Каминского, были возведены новые строения, включая здание по Малому Толмачевскому переулку, а также построена ограда с парадным входом со стороны Лаврушинского переулка.

В 1892 году Третьяков передал свою коллекцию Москве, которая включала 1287 картин, 518 рисунков и 9 скульптур русских художников XVIII-XIX веков, а также 75 картин его брата Сергея. Павел Михайлович стал пожизненным попечителем галереи. После его смерти в 1899-1900 годах дом был перестроен для нужд галереи, а в 1902 году здания по Лаврушинскому переулку объединили новым фасадом по проекту В. М. Васнецова, создав знакомый облик Третьяковской галереи.

В 1913 году попечителем галереи стал И. Э. Грабарь, который после революции возглавил ее. В 1920-х и начале 1930-х годов к галерее присоединили несколько соседних владений, включая закрытую церковь Святителя Николая в Толмачах. В 1936 году по проекту А. В. Щусева был построен дополнительный двухэтажный корпус, который вскоре стал частью основной экспозиции.

Во время Великой Отечественной войны экспонаты галереи были эвакуированы в Новосибирск и Пермь, а здание пострадало от налетов. К 1944 году большая часть залов была восстановлена.

В середине 1980-х началось строительство депозитария и нового музейного корпуса на углу с Большим Толмачевским переулком, который оказался неудачным с архитектурной точки зрения. Основной корпус был реконструирован с сохранением исторического облика, и работы завершились к 1995 году. В музейный ансамбль включена церковь Николы Чудотворца в Толмачах, ставшая домовым храмом-музеем, где хранится чудотворная Владимирская икона Божьей Матери.

Сегодня коллекция галереи насчитывает более 170 тысяч произведений искусства. Это не только один из известных мировых музеев, но и крупный научный и реставрационный центр.