Храм был построен в 1841-1844 годах по проекту губернского архитектора Карла Турского и освящён епископом Томским и Енисейским Афанасием. Средства на строительство предоставила единоверческая община Томска, а главным жертвователем и попечителем стал старообрядец П. И. Поздеев.

Позднее к храму добавили два придела: северный в честь священномученика Харалампия Магнезийского и южный в честь великомученика Димитрия Солунского. При храме действовали два одноклассных училища: Воскресенское мужское и женское. В начале XX века купец Н. Тихонов разбил вокруг храма сад.

В августе 1937 года епископ Серафим (Шамшин) был арестован и 17 сентября расстрелян. В храме большевики устроили погром, уничтожив иконы, книги и архивы. Храм фактически прекратил работу 27 сентября 1937 года по решению Томского горсовета, а официальное распоряжение о закрытии поступило 8 февраля 1940 года. К этому времени все храмы Томской епархии были закрыты, и она прекратила своё существование. Уже к 1938 году в городе не функционировало ни одно из 41 молельного здания.

В Свято-Троицкой церкви разместили склад Заготзерно, затем контору автоколонны «Сибхозтраса». Церковная утварь была передана в государственный фонд или выброшена, а книги и иконы сожжены. Здание пострадало: кресты были снесены, стены южного придела полуразрушены, двери, полы и оконные рамы сорваны.

После войны, в 1945 году, Троицкий храм разрешили открыть. Его удалось восстановить на народные средства. Из церкви села Зоркальцево привезли иконостас XVIII века. Восстановленный крест на колокольне украсили зеркалами вместо золота, которые сохранились до сих пор. 15 февраля 1946 года храм был вновь освящён по православному обряду и перестал быть единоверческим.

До начала 1990-х годов Петропавловский собор и Свято-Троицкий храм оставались единственными действующими православными храмами Томска.

Сегодня при храме работают воскресная школа и библиотека. На его территории находится надгробный памятник известного томского предпринимателя и мецената Е. И. Королёва.