Строительство собора длилось три года, и в 1838 году была завершена черновая отделка храма. 7 сентября 1840 года освятили правый придел в честь Рождества Пресвятой Богородицы, 18 января 1841 года, левый придел во имя святителя Николая Чудотворца, а 31 мая 1841 года, главный престол во имя Святой Живоначальной Троицы.

Из Михайло-Архангельского храма в Свято-Троицкий собор передали половину священных предметов: колоколов, книг и икон. Во второй половине XIX века вокруг собора сформировался новый городской центр, площадь вокруг храма назвали Троицкой. Строительством собора руководил местный чиновник земского суда Ватлашев А.Р. В 1863 году на колокольне установили главный колокол весом 333 пуда, около 5 тонн. В 1880 году собор был расписан.

В начале XX века собор оснастили электрическим освещением от первой электростанции в Бирске, которая также обслуживала дом Коновалова. В 1914 году к собору пристроили часть со стороны колокольни. Свято-Троицкий собор часто изображали на почтовых открытках как символ города.

В 1937 году большевики закрыли собор, и в том же году снесли колокольню. Главный колокол сняли и отправили в Уфу, но он так и не прибыл. Его судьба неизвестна, возможно, он был утоплен в реке Белой. Из кирпичей колокольни построили здание средней школы №2, ныне факультет технологии и предпринимательства. Кресты с собора сняли, а здание переделали под кинотеатр «Аврора». В 1932 году часть Троицкой площади отдали под сквер имени Ленина.

В 1956 году купол начал протекать, и местные власти решили проблему радикально, заменив его на двускатную крышу. В 1963 году в здании кинотеатра открыли общественный музей города, который работал с перерывами до конца 1980-х годов. Отсутствие капитального ремонта привело к разрушению храма, и попытки реставрации были безуспешными.

В 1992 году кинотеатр закрыли из-за аварийного состояния здания, и было решено, что дешевле построить новый кинотеатр. Здание бывшего собора находилось в плачевном состоянии: крыша протекала, окна были выбиты. Средств на реставрацию не нашлось, и здание законсервировали. В 1990-х годах решалась его дальнейшая судьба.

В 1994 году снова заговорили о реставрации, но средств не хватило. В 1996 году обсуждались идеи использования здания под исторический музей или другие цели. В 1997 году здание передали Уфимской епархии.

В 2000-е годы началась реставрация собора. В 2007 году началось восстановление купола, и были обнаружены 4 фрески евангелистов. В 2008 году работы приостановили. В 2012 году снова подняли вопрос о реставрации. 3 июня 2012 года епископ Амвросий совершил молебен в соборе, что стало началом его возрождения.

В январе 2013 года начались восстановительные работы. 3 апреля 2013 года епископ Амвросий заложил колокольню. 8 июня 2013 года установили основной купол и привезли 12 колоколов. 9 сентября 2013 года на звонницу подняли купол и крест, а также установили крест на главный купол храма.

14 сентября 2013 года, в честь 350-летия Бирска, состоялся крестный ход к собору, где провели водосвятный молебен и прочитали акафист. 8 января 2015 года в восстановленном соборе впервые за 78 лет прошла Литургия, и богослужения стали регулярными.

В июле 2017 года была образована Бирская епархия, и Свято-Троицкий собор стал ее главным храмом.