Первые сведения о Никольском соборе содержатся в Мосальской церковной десятине 1628 года, где он описан как небольшой деревянный храм с двумя приделами: Грузинской иконы Божьей Матери и апостолов Петра и Павла. Он находился внутри городской крепостной стены на горе, позже известной как Пятницкая.

В регулярном плане 1779 года, помимо существующих храмов: деревянного Никольского и каменных Пятницкого и Троицкого, предусматривалось строительство новых храмов в городе.

9 мая 1806 года, благодаря финансированию одного из богатейших жителей города, отставного майора А. С. Хлюстина, началось строительство нового храма на главной торговой площади. Проект разработал крепостной архитектор Хлюстиных, Ефим Егорович Латышев.

После смерти А. С. Хлюстина в 1909 году, строительство собора продолжили его сыновья: штабс-капитан Семен Антонович, надворный советник Михаил Антонович и действительный статский советник Николай Антонович. Завершение строительства произошло в 1818 году.

29 сентября 1818 года епископ Калужский и Боровский Антоний (Соколов) освятил собор в честь святителя Николая Чудотворца. На следующий день, 30 сентября, были освящены приделы в честь Грузинской иконы Божией Матери и апостолов Петра и Павла.

Из старого деревянного храма в новый собор перенесли церковную утварь и иконы. Колокола также переместили на новую колокольню. Вокруг собора возвели ограду с башенками по углам, три из которых служили часовнями, а четвертая использовалась как сторожка.

В храме служил протоиерей Иоанн Филиппович Чупров, а его сын Александр Иванович Чупров, крещенный здесь, сначала пошел по стопам отца, но затем, поступив в Императорский Московский Университет, стал известным ученым-экономистом и общественным деятелем.

В конце 1920-х, начале 1930-х годов храм, как и многие другие, был закрыт, колокола и крест сброшены, иконостас разграблен. В 1930 году арестовали викарного епископа Калужской епархии Стефана (Виноградова), его кафедра находилась в Никольском соборе. Его, протоиерея Иоаникия Виноградова и диакона Иоанна Никольского приговорили к пяти годам исправительно-трудовых лагерей, заменив на пять лет ссылки. В конце 1930-х снесли купол собора.

После закрытия здание использовали как Дом культуры, где проводились танцы и показывали кино. После войны в нем разместили библиотеку и кинотеатр. В 1950-х годах храм разобрали на кирпичи, оставив только колокольню, которую использовали как водонапорную башню. В какой-то момент на ней даже установили красную светящуюся звезду.

В 1999 году по инициативе администрации Мосальского района началось восстановление храма по старому проекту. Первой отреставрировали колокольню, и 1 января 2000 года над Мосальском прозвучал колокольный звон. 11 июня 2000 года архиепископ Калужский и Боровский Климент освятил основание возрождающегося собора. Строительство завершилось к концу 2000 года благодаря финансированию Нефтяной компании «ЮКОС».

В процессе восстановления обнаружили склеп с останками майора А. С. Хлюстина, который по завещанию был погребен в соборе. Также нашли серебряную доску с записями о строительстве храма. В июле 2000 года останки Хлюстина были повторно освящены и перезахоронены.