К концу XV и началу XVI века деревянные церкви Борисоглебского монастыря пришли в упадок. По указу великого князя Василия III и на его средства в 1522 году на месте деревянной церкви, посвященной святым князьям Борису и Глебу, был заложен первый каменный храм. Его строительство завершилось через два года, и 22 сентября 1524 года храм был освящен. Считается, что его построил талантливый ростовский мастер Григорий Борисов.

Собор Бориса и Глеба представляет собой небольшой четырехстолпный одноглавый храм, типичный для русской архитектуры XV-XVI веков. Такие соборы часто строились в городах, и их простой вид хорошо подходил для монастырских сооружений. Единственными украшениями собора являются перспективные порталы, карнизы и архивольты. Гладкие стены с низкими окнами разделены плоскими лопатками на три неравные части. Над четырехскатной крышей возвышается глава на мощном барабане. С востока к храму примыкают три пониженные алтарные апсиды.

Первоначальный вид собора был изменен поздними перестройками. Летом 1778 года при архимандрите Варлааме было решено надстроить барабан и заменить главу на "луковичную". Эти работы завершились в 1779 году, но новая глава нарушила гармонию постройки. Впоследствии она была покрыта деревянной чешуей, а в 1836 году добавлены четыре деревянных барабана с главками.

В 1780 году кровля храма была заменена на четырехскатную, скрывшую декоративный пояс из кокошников и древние окна. В 1925 году архитектор П.Д. Барановский обнаружил их и снял поздние барабаны.

Окна собора были расширены во второй половине XVII века, когда велись масштабные работы. Тогда же появились большие окна над порталами.

Внешний вид собора также изменил придел Ильи Пророка, пристроенный в 1810 году. При его строительстве были разрушены древняя паперть и украшения западного портала.

Внутренний облик собора прост: гладкие стены, отсутствие лопаток, арки на четырех столбах. Свет проникает через узкие окна. Иконостас, некогда примыкавший к восточным столбам, был золочен червонным золотом.

Согласно монастырским описям XVIII века, храм в XVI веке не был расписан. В 1735 году в соборе был только образ Бориса и Глеба, а в 1779 году стены были покрыты известковой побелкой. В 1783 году храм был расписан, а в 1842 году иконостас и стены украшены новой живописью. В 1911 году под руководством художника Ф.Е. Егорова храм был расписан в византийском стиле.

Стены и своды храма покрывают картины на евангельские сюжеты с орнаментальными рамами. На столбах и стенах апсид изображены московские митрополиты и другие святители. Росписи выполнены в академической манере.

В 1956 году архитектор Б.А. Огнев обнаружил фреску XVI века в аркосолии северной стены. На ней изображены святые князья Борис и Глеб, основатели монастыря Федор и Павел, а также великий князь Владимир и ростовский святитель Леонтий.