Памятник не имеет летописной даты. Впервые церковь Троицы упоминается в 1571 году в связи со свадебным разрядом царевича Ивана Ивановича. С конца 1560-х годов до 1582 года священником собора был известный композитор эпохи Ивана Грозного Фёдор Крестьянин.

После польско-литовской интервенции она была одной из четырёх церквей, пострадавших на Государевом дворе. В 1641 году пустующая церковь была отремонтирована и освящена, рядом с ней были построены новые «царские хоромы», деревянная часть дворца. В 1680 году церковь Троицы была перестроена в большую монастырскую трапезную церковь.

С западной стороны к ней была пристроена двустолпная палата с шатровой колокольней, церковный шатёр был дополнен восьмигранным купольным сводом, алтари расширены, а на юго-восточном углу появился новый придел Фёдора Стратилата, заменивший старый у северо-восточного угла. После завершения строительства Троицкая церковь была переосвящена: её престол переместили в соседнюю Покровскую церковь (ныне Троицкий собор), а престол собора, в Троицкую.

До 1990-х годов датировка шатровой Троицкой церкви относилась ко второму строительному периоду Слободы, времени пребывания Ивана IV (с 1565 по 1582 год). Строительство могло начаться ранее приезда Грозного, поэтому ориентировочно принимались 1560-е или 1570-е годы. Основанием для такой датировки служил её шатровый верх, так как первым шатровым храмом считалась церковь Вознесения в Коломенском, построенная в 1529-1532 годах. На этой основе Троицкая церковь не могла быть датирована первым строительным периодом Слободы, 1510-ми годами (временем Василия III).

Эта датировка сохранялась до исследований В. В. Кавельмахера. В 1980-1990-е годы он провёл масштабные раскопки и зондажи, выявившие, что Покровский собор, Троицкая церковь, Успенская церковь и церковь Алексея митрополита (ныне Распятская колокольня) в Александровской слободе были построены в одном строительном периоде, 1510-е годы. Это подтвердили и дальнейшие исследования С. В. Заграевского, сына Кавельмахера. Однако эта версия пока не признана другими авторитетными исследователями.

Таким образом, можно предположить, что церковь Троицы была построена Василием III в его резиденции, которую позже унаследовал Иван Грозный.

Согласно одному из предположений, именно в Покровской церкви служил распевщиком один из первых известных русских композиторов, Фёдор Крестьянин.

В XVII веке храм оказался окружён новыми постройками и как бы «утопленным» среди них. Среди пристроек была четырёхгранная шатровая колокольня с часами, исчислявшими время по восходу и заходу солнца. Фрагменты старинного часового механизма хранятся в местном музее.

В XVIII и XIX веках бывшая придворная церковь подвергалась многочисленным изменениям, исказившим её первоначальный облик. В северной стене были глубокие трещины и деформации. Комплексная реставрация проводилась в 1960-64 годах, в ходе которой были восстановлены четырёхскатная крыша трапезной и лемеховое покрытие шатра.

В XVI веке храм был расписан. Фрески сохранились в основном в шатре, фрагменты найдены в средней апсиде и на откосах западного окна. В 1863 году по инициативе купчихи Зориной древняя живопись была заменена новой, тогда же был заменён иконостас.

Троицкая церковь относится к типу шатровых храмов, близкому к традиционному, с тремя апсидами и четвериком, завершённым горизонтальной тягой, с кокошниками на гранях восьмерика. Древнее ядро церкви включает саму церковь, двойной белокаменный подклет и заалтарную казённую палату. Под подклетом находятся два глубоких погреба. Все помещения, расположенные в три этажа, начиная с погребов, имеют поперечную ориентацию и слегка вытянутый план. Главный фасад здания, южный, был обращён к центру дворца Василия III.

Церковь и палата представляют собой сочетание двух взаимопроникающих объёмов разной высоты и конфигурации. Церковный четверик стоит на высоком белокаменном цоколе и увенчан белокаменным карнизом оригинального профиля. Четверик и шатёр украшены кирпичными ковчегами-впадинами.

Церковь Троицы построена из большемерного кирпича и белого камня на дубовых и металлических связях, на высококачественном известковом растворе. Кладка смешанная, и от яруса к ярусу объём белого камня уменьшается. В третьем ярусе из белого камня полностью выложены только казённая палата и три алтарных апсиды. В отделке церкви и придела преобладает кирпич. Из белого камня выполнены цоколи, лопатки и порталы (не полностью), конструктивные элементы карнизов и кокошников, а также облицованы до половины высоты стены в интерьере. Верхние части здания почти полностью кирпичные.

Белокаменные порталы храма выполнены иностранным художником. Южный и северный порталы, а также портал придела Фёдора Стратилата, щипцовые; западный имеет полуциркульный верх. Уникальная черта архитектуры XVI века, аркасолий под западной стеной, возможно, захоронение кого-то из членов монаршей семьи.