Точное время строительства первого главного храма Успенского женского монастыря неизвестно. Из документов XVIII века следует, что это было каменное двухэтажное здание. На верхнем этаже находился престол в честь Успения Пресвятой Богородицы и придел в честь преподобного Александра Свирского, а на нижнем, престол в честь иконы Божией Матери «Неопалимая Купина» и придел Николая Чудотворца. Со временем здание обветшало, начало проседать, и первый этаж стал затапливаться водой в дождливые дни и весной. Церковь разобрали и в 1791, 1792 годах построили новую каменную, одноэтажную, на средства, выделенные Екатериной II, при содействии тульского гражданского губернатора Андрея Ивановича Лопухина. Главный престол освятили в честь Успения Пресвятой Богородицы, южный придел был посвящён иконе «Неопалимая Купина», а северный, Александру Свирскому. В 1857 году храм, уже в ветхом состоянии, был расширен, что только ускорило его разрушение.

В 1899 году началась разборка этой церкви, и к 1902 году на её месте возвели новое двухэтажное здание. Нижний теплый храм с одним престолом во имя равноапостольной Марии Магдалины и великомученика Пантелеймона освятили 24 октября 1902 года. Верхний, с главным престолом Успения, освятили 28 июня 1904 года, а приделы верхнего храма в честь иконы «Неопалимая Купина» и Александра Свирского, 11 июля 1910 года и 3 июля 1911 года соответственно.

Успенская церковь была построена в неорусском стиле. Сохранился её первоначальный проект, который близок к построенному храму, но предусматривал несколько иные декоративные элементы. В процессе строительства отказались от готических элементов декора и стрельчатых обрамлений окон на барабанах. Не стали делать и горизонтальное трехчастное деление фасадов окнами, так как это сделало бы здание трехэтажным. Стены верхней церкви расписывались в 1909 году. Возможно, художники были соратниками Виктора Васнецова, так как росписи храма являются точными копиями его работ в Киевском Владимирском соборе. На стене верхнего храма сохранилась надпись: «В 1909 году тщанием настоятельницы игуменьи Магдалины, с помощью благотворителей, соборный храм сей украшен стенным писанием и орнаментом». Стены собора сложены из тёмно-красного кирпича, а черные купола увенчаны крестами и полумесяцами. В соборе была похоронена почитаемая в Туле игуменья Агния, занимавшаяся строительством храма.

С приходом к власти большевиков монастырь был упразднён, а собор закрыт. В 1930-х годах его пытались взорвать, но собор оказался очень прочным и выстоял. Тогда с него сняли купола и разместили филиал государственного архива. В конце 1980-х была проведена реконструкция здания, в ходе которой вновь установили купола и укрепили основание собора.

8 сентября 2006 года собор был возвращён верующим, а 24 января 2007 года архиепископ Тульский и Белевский Алексий освятил престол нижнего храма, куда были перенесены мощи святого Иоанна Тульского. 10 мая 2012 года в Свято-Успенском кафедральном соборе торжественно освятили второй этаж, что ознаменовало завершение реставрационных работ храма.