Свято-Троицкая церковь была одной из первых временных церквей, четвёртой по счёту после Успенской соборной, Воскресенской госпитальной и Никольской казачьей. Её построили и освятили в 1740 году для Пензенского полка, а в 1745 году перенесли из Самары в Оренбург, который стал центром управления Оренбургским краем в 1743 году. В 1744 году церковь стала военной для батальона Нижегородского полка, переведённого из Уфы. Первоначально деревянная, она была перестроена в камне в 1781-1786 годах. Из первых четырёх церквей только Троицкая сохранилась до советского времени. Остальные прекратили существование: Успенская была заменена Введенским каменным собором в 1758 году, Никольская сгорела в 1786 году, а Воскресенская была разобрана из-за ветхости и заменена Крестовоздвиженской церковью в 1770 году.

Строительство каменной Троицкой церкви началось в 1774 году на казённые средства и пожертвования горожан в память освобождения Оренбурга от осады пугачёвскими войсками. Из-за нехватки средств после долгой осады строительство длилось восемь лет, и церковь освятили в 1783 году. Здание неоднократно страдало от городских пожаров, особенно в 1786 и 1879 годах. Колокольню пристроили в 1807 году, а в 1828 году добавили два придела: правый в честь Успения Пресвятой Богородицы и левый во имя святителя Николая Чудотворца, в память исчезнувших церквей Успенской и Николаевской. Главный престол был посвящён Святой Живоначальной Троице.

В 1876 году на средства старосты Григория Пожарского храм обнесли чугунной оградой с каменными столпами и воротами. После пожара 1879 года церковь восстанавливали на пожертвования, собранные прихожанами и по подписке в разных городах. В сборе средств активно участвовали купец Иван Шибаев и служители церкви, включая настоятеля Матвея Любочестнова. Купцы Зарывновы, Мошковы, Ванюшины, Рыжковы и братья Сачковы, а также Михаил Моталев внесли значительные вклады. На средства Василия Мякинькова и Ивана Сачкова был создан позолоченный иконостас с 22 иконами, четыре из которых выполнены Московской академической школой живописи. Церковь была освящена 21 марта 1882 года. Её украшали вызолоченные купола и кресты, а вокруг росли деревья и сирень. У ограды хоронили почётных горожан.

После реставрации церковь вмещала до полутора тысяч человек. Она стояла на небольшой площади рядом с рыбными лавками и домом княжны Имеретинской. Южная сторона выходила на Неплюевскую улицу, напротив которой находились женские учебные заведения. В 1892 году прихожане построили на рынке часовню с пятью главами в память спасения царской семьи в 1888 году. При церкви также был дом с квартирами для нуждающихся.