Существуют разные мнения относительно времени постройки Златоустинской (Мироносицкой) церкви. Одни исследователи относят её к началу XVIII века, другие предполагают, что храм мог быть возведён и в XVI веке. Клировые ведомости указывают на XVII век, но точный год строительства не уточняется.

Эта уникальная церковь расположена на пересечении Набережной VI армии и улицы Энгельса, которые ранее назывались Златоустинскими благодаря храму.

Архитектурно храм Иоанна Златоуста имеет прямые аналоги в монастырском строительстве, например, в Спасо-Прилуцком монастыре есть похожая церковь, теплая церковь Введения во храм Пресвятой Богородицы, относящаяся ко второй половине XVI и XVII веков.

Двухэтажный Златоустинский храм по своему объёмному решению напоминает церковь Константина и Елены: двусветный куб на подклете с пятью крупными куполами, пониженными прямоугольными пристройками, алтарём и папертью, а также колокольней на северо-западном углу. Звонница, самая удачная и типичная часть храма. На мощный четверик поставлен узкий восьмерик звона, покрытый пирамидальным каменным шатром с двумя рядами слуховых окон и завершённый главой. Характер кладки и украшений подтверждает, что колокольня была построена до XVIII века.

Церковь является одним из первых двухэтажных храмов Вологды. Она состоит из двух помещений: нижней и верхней церквей. Это отражает идею преемственности двойных вологодских церквей, объединяющих холодную и тёплую церкви в одном здании. Престол верхней церкви освящён во имя Иоанна Златоуста, а нижней, во имя Жен Мироносиц.

В начале XX века Златоустинская церковь была упразднена, а в советское время закрыта.

В начале 2000-х годов церковь была возвращена верующим и стала приписной к церкви Покрова на Торгу.

В 2010 году начались работы по реконструкции храма под контролем Департамента культуры и охраны объектов культурного наследия Вологодской области.

Согласно указу от 25 июня 2014 года, епископ Вологодский и Великоустюгский Игнатий образовал приход храма святителя Иоанна Златоуста Вологды Вологодской епархии Русской Православной Церкви, Московский Патриархат. Настоятелем храма был назначен иерей Алексий Калин.