2 июня 1890 года священник Василий Коблов из станицы Кардаиловской был назначен первым настоятелем нового храма. 30 сентября 1890 года, накануне праздника Покрова Божией Матери, епископ Оренбургский и Уральский Макарий освятил третий храм в новой слободке Оренбурга, посвященный святому великомученику Димитрию Солунскому, в присутствии большого количества верующих.

Со временем стало ясно, что храм слишком мал и нуждается в расширении. В 1895 году оренбургский епархиальный архитектор разработал проект с двумя пристройками для алтарей, но из-за нехватки средств реализация затянулась. Благодаря пожертвованиям прихожан и благотворителей, включая купца 2-й гильдии Максима Макеева, был построен правый придел в честь Святой Троицы, освященный 1 августа 1899 года. В 1900 году завершилось строительство левого придела в честь Успения Божией Матери на средства генерала-майора Черехова и Макеева, ставшего церковным старостой. Настоятель храма, протоиерей Александр Словохотов, обратился к епископу Владимиру с просьбой освятить престол 13 августа 1900 года.

В 1920-е годы Дмитриевская церковь была передана обновленческой общине из-за невыполнения условий договора. В 1930-х годах храм использовался двумя общинами: «староцерковной» и обновленческой. В 1933 году церковь закрыли, но в 1935 году вновь открыли, и после закрытия Казанского Кафедрального собора сюда перенесли архиерейскую кафедру. Однако православным принадлежал только левый придел, а центральный и правый оставались у обновленцев. 17 сентября 1938 года церковь была окончательно закрыта, а в январе 1939 года здание передали Облкинотресту для переоборудования в кинотеатр.

Во время Великой Отечественной войны на территории храма находилась автомобильная рота Южно-Уральского округа. 5 января 1944 года верующие обратились в горсовет с просьбой открыть церковь, но получили отказ из-за занятости помещения. Последующие обращения в 1944 и 1946 годах также были отклонены, несмотря на то, что рота освободила территорию. Позже здесь открылся кинотеатр «Буревестник», просуществовавший более полувека.

В августе 1989 года группа верующих зарегистрировала новое религиозное общество РПЦ в Центральном райисполкоме Оренбурга. 27 сентября 1989 года Совет по делам религий разрешил обществу приобрести жилой дом для молитвенных целей. 12 февраля 1990 года здание бывшего Дмитриевского храма было возвращено Православной Церкви.

27 февраля 1996 года при большом скоплении прихожан и жителей улиц Попова и Островского был установлен купол церкви. К ноябрю 1999 года в храм привезли Табынский образ Божией Матери и икону святого Димитрия Солунского. Позже завершилось строительство колокольни, и 16 августа 1999 года митрополит Оренбургский и Бузулукский Валентин отслужил молебен на ее открытие.