Im Jahr 1657 wurde in Charkiw die erste hölzerne Kirche der Uspenskaja Gottesmutter erbaut, die sich in der Festung etwas südlich der heutigen Uspenski-Kathedrale befand. Sie war klein, kalt und arm, mit einem Mangel an Gottesdienstbüchern und Papierikonen. Mit dem Wachstum der Stadt und dem Erscheinen neuer Kirchen konnte die Uspenskaja Kirche nicht mehr alle Gläubigen fassen. In den Jahren 1685-1687 wurde an ihrer Stelle die erste steinerne Kathedrale errichtet, die die erste in Charkiw wurde. Wie die meisten Kathedralen hatte sie eine kreuzkuppelartige Konstruktion, und ihr Dach sowie die fünf Kuppeln waren mit Eichenbrettern gedeckt. Nebenan stand ein steinerner Glockenturm mit zwei „Kammern“ und einem Keller, die vermietet wurden und der Kirche Einnahmen brachten. Am 3. März 1733 zerstörte ein Feuer die Kathedrale und ließ nur die steinernen Wände stehen. Ein Jahr später wurde sie wiederhergestellt, die Kuppeln wurden mit weißem Blech gedeckt und das Kreuz vergoldet, aber bald traten Risse im Gebäude auf. In den 70er Jahren des 19. Jahrhunderts wurde sie abgerissen, um eine neue Kathedrale zu bauen, die dem Status Charkiws als Handels- und Industriezentrum der Sloboda-Ukraine-Gouvernement entsprach. Die alte Kirche entsprach nicht dem Geist der Katharinenzeit.

Bei der Planung der neuen Kirche diente der Tempel des hl. Clemens in Moskau als Vorbild, der in den Jahren 1762-1770 erbaut wurde. Ihr Merkmal war der quadratische Grundriss und das Fehlen halbrunder Apsiden. Der zentrale Lichttrommel der Kuppel ruhte auf vier Pylonen, und die Ecktürme waren nicht mit dem Innenraum verbunden. Das äußere Erscheinungsbild der Kathedrale spiegelte den Übergang vom Barock zum Klassizismus wider. Die Fassaden waren zurückhaltend, mit Stuckverzierungen, die an das Barock erinnerten. Die Innenräume zeichneten sich durch Pracht aus, darunter der geschnitzte, vergoldete Ikonostase, der nach einem Entwurf von Rastrelli gefertigt wurde.

Der Bau der Kathedrale dauerte zwölf Jahre und wurde im Juni 1783 abgeschlossen. Die neue Kathedrale war erheblich größer als die alte und hatte vier Altäre: den Hauptaltar der Uspenskaja, den südlichen zu Ehren der Gottesmutter von Kasan, den nördlichen zu Ehren der Heiligen Katharina und einen weiteren in den Chören zu Ehren von Petrus und Paulus. Stolz der Kathedrale waren die Ikonen der Eletska Gottesmutter und des heiligen Nikolaus. Nach der Fertigstellung der Kathedrale stellte sich die Frage nach dem Bau eines neuen Glockenturms, dessen Entscheidung 1819 getroffen wurde. Im Glockenturm wurde ein Tempel zu Ehren von Alexander Newski eingerichtet, zur Erinnerung an den Sieg im Vaterländischen Krieg von 1812. Der Bau begann am 8. Mai 1821 und dauerte mit Unterbrechungen bis 1833. 1837 wurden die Arbeiten unter der Leitung des Architekten K.A. Ton wieder aufgenommen. 1841 wurde auf dem Glockenturm ein vergoldetes Kreuz mit einem Gewicht von 400 kg und einer Höhe von 5 m installiert. Die Arbeiten wurden 1844 abgeschlossen, und der Glockenturm wurde der höchste der Stadt, mit 12 Glocken und einer Uhr, die in Paris bestellt wurden. Der mit dem Tempel verbundene Glockenturm wurde zur Hauptdominante des Stadtzentrums und vereinte die Stile des Barock und Klassizismus.

Nach der Revolution von 1917 wurden die Kathedrale und der Glockenturm nicht mehr ihrem Zweck entsprechend genutzt und erlitten Zerstörungen. 1973 begann die Restaurierung, bei der die Fundamente und Wände verstärkt, die Trommeln und die Kuppel wiederhergestellt und die Ausstattung erneuert wurden. 1986 wurde im Gebäude das Haus für Orgel- und Kammermusik eröffnet.

Am 29. Oktober 2004 wurde durch den Erlass des Leiters der Charkiw-Oblastverwaltung E.P. Kushnarev der Komplex der Uspenski-Kathedrale in die Verwaltung der UOC übergeben, aber die Entscheidung wurde vor Gericht angefochten. 2006 wurde das Kreuz auf dem Glockenturm wiederhergestellt. 2009 wurde die Kathedrale der Charkiw-Eparchie der UOC übergeben, und bis 2010 fanden dort Konzerte und Gottesdienste statt. 2016, nach der Eröffnung des neuen Konzertsaals, ging die Kathedrale vollständig in die Verwaltung der Eparchie über.