Er wurde in Zarskoje Selo als fünfter Sohn von Alexander II. und Maria Alexandrowna geboren. Er nahm am Russisch-Türkischen Krieg von 1877 und 1878 teil. Ab Februar 1887 leitete er das Leibgarde-Preobraschenski-Regiment. Ab dem 26. Februar 1891 war er Gouverneur von Moskau und ab Mai 1896 gleichzeitig Kommandeur der Truppen des Moskauer Militärbezirks im Rang eines Generalleutnants. Seit Dezember 1894 war er Mitglied des Staatsrates. Ab 1892 war er Ehrenmitglied der Berliner orthodoxen Heiligen Fürst-Wladimir-Bruderschaft, die unter dem Schutz des Großherzogs Wladimir Alexandrowitsch stand. Am 4. Februar 1905, gegen drei Uhr nachmittags, als der Großherzog mit einer Kutsche aus dem Nikolauspalast im Kreml fuhr, wurde er beim Heranfahren an den Nikolai-Turm von einer Bombe getötet, die von Ivan Kaljajew, einem Mitglied der „Kampforganisation der Sozialrevolutionären Partei“, geworfen wurde. Zwei Tage zuvor hatte Kaljajew das Attentat abgebrochen, als er die Frau und die kleinen Neffen des Fürsten in der Kutsche sah. Der Großherzog starb sofort, der Kutscher erlitt tödliche Verletzungen, und die Kutsche wurde zerstört. Der Körper des Fürsten wurde durch die Explosion zerrissen; nach der Einbalsamierung und Einfrierung wurden die Überreste in einen Sarg gelegt, der in der Kathedrale des Kremls im Tschudow-Kloster aufgestellt wurde.